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糖鎖量子ドットを用いた蛍光イメージング法によるゴルジ体酵素の１分子キネティクス

使用聚糖量子点进行荧光成像的高尔基体酶的单分子动力学

基本信息

批准号：
24710241
负责人：
長堀紀子
金额：
$ 3万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2013-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

糖脂質合成を担うシアル酸転移酵素である SiaT1 は、ゴルジ膜上で GalT1 および Sia2とヘテロダイマーを形成することが知られている。この3種類の糖転移酵素について異なる蛍光タンパク質でラベル化し、1分子蛍光顕微鏡を用いた解析行うことで、GalT(モノマー)、GalT1(ホモ)、 GalT1-SiaT(ヘテロ)、SiaT1(モノマー)、SiaT1(ホモ)、SiaT1-SiaT2(ヘテロ)、SiaT2(モノマー)、 SiaT2(ホモ)について、それぞれの酵素複合体を1分子ずつ(複合体をひとつずつ)区別して解析することを目的として実験を開始した。<糖鎖量子ドット作製方法の改良>糖鎖量子ドットより簡単に作製できるように、作製手順･方法についての条件検討を行った。<蛍光ラベルした糖転移酵素遺伝子の作製>WT-MEFおよびSiaT1-KO MEFについて、その糖脂質および糖タンパク質発現プロファイル解析を行ったところ、WT-MEFではいずれの標的糖転移酵素も発現していることが支持された。SiaT1は糖脂質を基質として作用し、糖タンパク質（N-グリカン）には反応しないにもかかわらず、糖タンパク質糖鎖プロファイルに顕著な変化が観察された。この糖鎖解析方法および観察された現象については、論文として報告済みである。次に、WT MEFよりmRNAを抽出し、逆転写反応によって得られたDNA混合物をテンプレートして、各標的糖転移酵素に対応するプライマーを用いてPCR反応を行い、各糖転移酵素遺伝子のクローニングを行った。反応条件検討およびシーケンス確認の結果、３種の標的遺伝子のうち、SiaT1,SiaT2については正しい配列の遺伝子を得られた。現在GalTについての反応条件の最適化およびシーケンス確認を行うと共に、蛍光タンパク質との融合タンパク質を生成するための遺伝子を作製中である。

Carbohydrate and lipid synthesis are important for the development of enzymes. These three types of sugar transfer enzymes are used for analysis, GalT(), GalT1 (), GalT1-SiaT(), SiaT1 (), SiaT1-SiaT2 (), SiaT3 (), SiaT4 (), SiaT5 (), SiaT6 (), SiaT7 (), SiaT8 (), SiaT9 (The enzyme complex is the first molecule to be analyzed <Improvement of sugar lock quantum device manufacturing method> sugar lock quantum device manufacturing method WT-MEF and SiaT1-KO MEF support the development of target glycometase in the context of the analysis of glycometase and glycometase in WT-MEF. SiaT1 is a carbohydrate lipid matrix that acts as a substrate for sugar and lipid (N-glucose). The method of sugar lock analysis is to observe the phenomenon of sugar lock. PCR amplification of the target enzyme and DNA mixture was carried out. The results of the reverse conditional search were confirmed. Three kinds of target genes were detected. SiaT1 and SiaT2 were detected. The optimization of GalT's reaction conditions is now in progress.