大量情報データを基盤としたイネ雄性生殖器官の分化・発達・成熟における分子機構解明

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イネの雄性生殖器官に焦点を当て分子生物学的・情報生物学的研究を行い、葯および花粉の分化・発達・成熟過程の分子ネットワークの解明を目標に、平成20年は以下の研究を行った。1. 雄性生殖における器官・ステージ特異的遺伝子に関する研究イネ品種日本晴の葯発達ステージに対して雄性生殖組織特異的にサンプル調整した。葯の発達は組織切片のDAPI染色により正確なステージを確認し、レーザーマイクロダイセクション(LMD)を用いて減数分裂期、四分子期、1細胞性花粉期、2細胞性花粉期、3細胞性花粉期の花粉とタペート組織(3細胞性花粉期は花粉のみ)を精密にサンプリングした。その後これらサンプルから純粋なTotal RNAを抽出し、44kマイクロアレイ解析を行い、各葯の発達ステージ毎の遺伝子発現プロファイルを獲得した。2. 雄性生殖器官特異的miRNA同定に関する研究日本晴を材料とし、葯の発達過程をDAPI染色により正確に確認し、減数分裂期〜四分子期、1細胞性花粉期、2細胞性花粉期、3細胞性花粉期の葯サンプルを調整した。それぞれのステージサンプルより抽出した純粋なTotal RNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズ分画を行い、18-30塩基程度のsmall RNA画分をゲルから抽出した後、得られたsmall RNA画分に対して5'と3'末端へのアダプター付与・RT-PCRによりsmall RNA-cDNAライブラリーを構築した。高速シーケンサーを用いて各ステージのsmall RNAの塩基配列解読を行い(約500Mb)、各ステージから数万クローンの塩基配列の情報を得た。