組織特異的ノックアウトマウスを用いた角膜上皮細胞におけるHB-EGFの役割の検討

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野生型(WT)マウス、組織特異的HB-EGFノックアウト(HB-KO)マウス共に分離した培養上皮細胞(MCECs)を用いて実験を引き続き行った。1)細胞増殖実験 以前に創傷負荷44時間後の結果について報告したが、今回24時間後における細胞増殖も検討した。100%コンフルエントになるまでMCECsを培養したのち、ピペットチップにて創傷を作成した。HB-EGF無添加群と添加群において、創傷負荷24時間後の1,000細胞数あたりのBrdU陽性細胞数を計測した。その結果、HB-EGF無添加群ではWTとHB-KOの間に有意な差は認めなかったが、HB-EGFを添加すると、両者ともBrdU陽性細胞数は有意に増加した。HB-EGFは細胞増殖効果があることが示されたが、EGFファミリーは、自分自身の発現を増強するauto-induction機構や他のファミリーの発現を増強するcross-induction機構をもっていることが報告されているため、他のEGFファミリーの創傷治癒における発現も検討した。2)MCECsの創傷治癒におけるEGFファミリーの発現100%コンフルエントになったMCECsに縦横5本ずつの創傷をピペットチップにて作成し、HB-EGF無添加および添加群として各タイムポイント毎にtotal RNAを抽出し、リアルタイムPCRにてEGFファミリーの発現を検討しました。創傷を作成していないものをコントロールとした。WTの結果では、HB-EGF無添加群ではHB-EGFとEpiregulinの発現が増強されたが、HB-EGF添加によりHB-EGFでは約53倍、Epiregulinでは約20倍と発現が大きく増強された。EGF,TGF-aの発現はほとんど増強されなかった。HB-KOではEpiregulinの発現が増強されたが、HB-EGF添加により発現は38倍と、さらに大きく増強された。WTと同様、EGF,TGF-aの発現はほとんど増強されなかった。このようにHB-EGFは他のEGFファミリーとも相互作用があることが示された。HB-EGFの細胞増殖効果はEpiregulinが関与している可能性もあると考えられた。詳細な働きについてはさらなる検討が必要である。3)HB-EGFが制御する接着因子の検索in vitroでの細胞接着率の検討でHB-EGFの細胞接着に対する促進効果は以前に報告しているが、今回primer arrayを用いてin vitroの創傷負荷モデルにおける接着因子の増幅の有無を検討した。その結果HB-KO MCEsにおいてHB-EGF添加により2倍以上発現が増強された接着因子をピックアップしたところ、角膜上皮でも重要な働きをするとされるインテグリンファミリーのうちのインテグリンα6とβ1の発現の増強が認められた。これについては、HB-KO MCECsで各タイムポイントで改めてリアルタイムPCRを施行したところ、インテグリンα6 β1ともにHB-EGFを添加すると創傷負荷6時間をピークに発現が増強された、インテグリンα6はβ4とヘテロダイマーを形成し、ヘミデスモソームの構成成分として基底膜との接着に関与しており、またβ1は角膜上皮に広く発現し、多くのインテグリンαサブユニットとヘテロダイマーを形成することができることより、HB-EGFがインテグリンα6およびβ1の制御に関与している可能性が示唆された。詳細な働きについては今後のさらなる研究が必要である。