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組織特異的ノックアウトマウスを用いた角膜上皮細胞におけるHB-EGFの役割の検討

使用组织特异性敲除小鼠检查 HB-EGF 在角膜上皮细胞中的作用

基本信息

批准号：
20659270
负责人：
吉岡龍治
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Ehime University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-20659270/
关键词：
HB-EGF 角膜上皮マウス培養角膜上皮細胞創傷治癒

项目摘要

野生型(WT)マウス、組織特異的HB-EGFノックアウト(HB-KO)マウス共に分離した培養上皮細胞(MCECs)を用いて実験を引き続き行った。1)細胞増殖実験以前に創傷負荷44時間後の結果について報告したが、今回24時間後における細胞増殖も検討した。100%コンフルエントになるまでMCECsを培養したのち、ピペットチップにて創傷を作成した。HB-EGF無添加群と添加群において、創傷負荷24時間後の1,000細胞数あたりのBrdU陽性細胞数を計測した。その結果、HB-EGF無添加群ではWTとHB-KOの間に有意な差は認めなかったが、HB-EGFを添加すると、両者ともBrdU陽性細胞数は有意に増加した。HB-EGFは細胞増殖効果があることが示されたが、EGFファミリーは、自分自身の発現を増強するauto-induction機構や他のファミリーの発現を増強するcross-induction機構をもっていることが報告されているため、他のEGFファミリーの創傷治癒における発現も検討した。2)MCECsの創傷治癒におけるEGFファミリーの発現100%コンフルエントになったMCECsに縦横5本ずつの創傷をピペットチップにて作成し、HB-EGF無添加および添加群として各タイムポイント毎にtotal RNAを抽出し、リアルタイムPCRにてEGFファミリーの発現を検討しました。創傷を作成していないものをコントロールとした。WTの結果では、HB-EGF無添加群ではHB-EGFとEpiregulinの発現が増強されたが、HB-EGF添加によりHB-EGFでは約53倍、Epiregulinでは約20倍と発現が大きく増強された。EGF,TGF-aの発現はほとんど増強されなかった。HB-KOではEpiregulinの発現が増強されたが、HB-EGF添加により発現は38倍と、さらに大きく増強された。WTと同様、EGF,TGF-aの発現はほとんど増強されなかった。このようにHB-EGFは他のEGFファミリーとも相互作用があることが示された。HB-EGFの細胞増殖効果はEpiregulinが関与している可能性もあると考えられた。詳細な働きについてはさらなる検討が必要である。3)HB-EGFが制御する接着因子の検索in vitroでの細胞接着率の検討でHB-EGFの細胞接着に対する促進効果は以前に報告しているが、今回primer arrayを用いてin vitroの創傷負荷モデルにおける接着因子の増幅の有無を検討した。その結果HB-KO MCEsにおいてHB-EGF添加により2倍以上発現が増強された接着因子をピックアップしたところ、角膜上皮でも重要な働きをするとされるインテグリンファミリーのうちのインテグリンα6とβ1の発現の増強が認められた。これについては、HB-KO MCECsで各タイムポイントで改めてリアルタイムPCRを施行したところ、インテグリンα6 β1ともにHB-EGFを添加すると創傷負荷6時間をピークに発現が増強された、インテグリンα6はβ4とヘテロダイマーを形成し、ヘミデスモソームの構成成分として基底膜との接着に関与しており、またβ1は角膜上皮に広く発現し、多くのインテグリンαサブユニットとヘテロダイマーを形成することができることより、HB-EGFがインテグリンα6およびβ1の制御に関与している可能性が示唆された。詳細な働きについては今後のさらなる研究が必要である。

Wild-type (WT), tissue-specific HB-EGF (HB-KO), and co-cultured epithelial cells (MCECs) are used in the treatment of cancer. 1)Cell proliferation was reported after 44 hours of trauma loading, and cell proliferation was reported after 24 hours. 100% of MCCs are cultivated and damaged. The number of HB-EGF positive cells was measured 24 hours after injury. The number of HB-EGF positive cells in WT and HB-KO groups increased significantly, while the number of HB-EGF positive cells increased significantly. HB-EGF cell proliferation results are reported in this paper. EGF cell proliferation results are reported in this paper. 2) The development of EGF in MCECs during wound healing was 100% of the total RNA extracted from the total RNA. The first time I saw him, I was in the middle of a fight. The results showed that the expression of HB-EGF and Epiregulin increased significantly in the HB-EGF-free group, and the expression of HB-EGF and Epiregulin increased significantly in the HB-EGF-free group, and the expression of Epiregulin increased significantly in the HB-EGF-free group by about 53-fold. EGF,TGF-a and its development are not easy. The expression of Epiregulin in HB-KO increased by 38 times, and the expression of Epiregulin in HB-EGF increased by 38 times. WT, EGF,TGF-a and their development are not easy. This is the first time that the EGF has been used. HB-EGF cell proliferation results are related to Epiregulin A detailed discussion is necessary. 3) The study of HB-EGF inhibitor adhesion factor in vitro; the study of HB-EGF inhibitor adhesion factor in vitro; The results showed that HB-KO MCEs increased by more than 2 times, and the corneal epithelium increased by 2 times. HB-KO MCECs are composed of various components, such as basement membrane, corneal epithelium, etc., which are related to the development of the corneal epithelium, such as α6 β1 and HB-EGF. The possibility of controlling the alpha and beta phases of EGF is demonstrated. Detailed research is necessary in the future.