ナノ技術を応用した新規遺伝子導入法の開発

应用纳米技术开发新的基因导入方法

基本信息

批准号：
10J00803
负责人：
大澤賢次
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kyushu Dental College (2011)Kyoto University (2010)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J00803/
关键词：
骨遺伝子導入再生医学プラスミドベクター骨形成因子(BMP)MEMS

项目摘要

ナノ技術を応用した新規遺伝子導入法の探索として、先端の大きさが10μmの針を用いて細胞膜を穿孔させ、その孔を通じて細胞外に存在する遺伝子(プラスミドベクター)を細胞内へ導入するという手法を用いて、骨形成因子(BMP-2)遺伝子導入による間葉系未分化細胞から骨芽細胞への分化誘導を目的に実験を行った。まず、マウス間葉系未分化細胞株C3H10T1/2に対して、今回の手法が有効であるかをLacZ遺伝子発現ベクターを導入し、X-gal染色を行って確認したところ、陽性細胞が確認できた。次に、添加するLacZ発現ベクター濃度を変化させ、それぞれの細胞培養ディッシュ上の100個の細胞に遺伝子導入操作を行い、導入効率の高い条件について検討を行ったところ、ベクターの添加濃度が0.3mg/mlで最も効率よく遺伝子導入され、100個の遺伝子導入操作を行った細胞に対して、染色陽性を示した細胞が最大で100個みられた。続いて、ヒトBMP-2遺伝子発現プラスミドベクターを用いて、同様に遺伝子導入を行った。まず、遺伝子導入後7日目の細胞を回収し、RT-PCRを行ったところ、導入遺伝子であるヒトBMP-2のmRNAの発現が確認された。つぎに、遺伝子導入後7日目の細胞に骨芽細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼ染色を行ったところ、染色陽性が確認された。さらに遺伝子導入後21日目の細胞を固定しVon Kossa染色を行ったところ、染色陽性が確認できカルシウムの沈着が確認できた。この結果から、極微細針を用いた遺伝子導入法は、これまで用いられてきたリポフェクションなどの試薬を用いた方法や、エレクトロポレーションなどの物理的エネルギーを用いる方法と比較して、高い導入効率を示し、この遺伝子導入法を応用して未分化細胞から骨芽細胞への分化誘導にも用いることが可能であることを示した。

为了使用纳米技术寻找一种新型的基因转移方法，我们进行了一个实验，其中使用具有10μm的尖端大小的针头打孔细胞膜，并通过孔中引入细胞外基因（质粒载体），以诱导与杂物不良的细胞介绍孔（构成孔）的目标，以实现孔隙。基因。首先，当我们引入LACZ基因表达载体以确定该方法是否对小鼠间充质的未分化细胞系C3H10T1/2有效，并通过X-GAL染色确认了阳性细胞。接下来，更改了LACZ表达载体的浓度，并在每个细胞培养皿上对100个细胞进行了基因转移，并检查了高转导效率的条件。对载体浓度为0.3 mg/ml的细胞染色阳性，染色为阳性，并且观察到基因转移阳性的最大细胞数量为100个被染色的细胞。随后，使用人BMP-2基因表达质粒载体以相同的方式进行基因转移。首先，在基因转移后的第7天收获细胞，并进行RT-PCR，以确认人BMP-2（转基因）的mRNA的表达。接下来，在基因转移后的第7天，用碱性磷酸酶，成骨细胞的标记和阳性染色对细胞进行染色。此外，细胞在基因转移后的第21天固定并染色von kossa，并确认染色为阳性染色，表明钙沉积。这些结果表明，与使用诸如Lipofection或使用物理能量（例如电穿孔）的方法相比，使用Ultrafine针的基因转移方法表现出更高的引入效率，并且该基因转移方法可用于诱导从未分化的细胞与成骨细胞的分化。