プロテオーム解析のための次世代分析手法の開発と応用

下一代蛋白质组分析方法的开发和应用

• 批准号: 10J04062
• 负责人: 岩崎 未央
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University (2011-2012)Keio University (2010)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J04062/
• 关键词: Proteomics; LC-MS/MS; HeLa; Monolithic column; proteomics; Escherichia coli; phosphopeptides

背景タンパク質を網羅的に同定・定量する際には、ナノ液体クロマトグラフィー―質量分析法(nanoLC-MS/MS)を用いたショットガンプロテオミクスを用いるのが一般的である。しかし、ショットガンプロテオミクスには主に以下の二つの問題点があり、試料中のすべてのタンパク質を1度に同定することは未だ困難である。(1)複雑性:ショットガンプロテオミクスでは試料中のタンパク質を断片化して測定するため、試料の複雑性が非常に高くなる。ヒトでは最低でも約3千万種のペプチド断片が生じると考えられる。(2)濃度差:ヒトタンパク質間の発現量の差は最大で106倍あり、発現量の差が大きいタンパク質由来のペプチドが質量分析計に同時に打ち込まれると、イオン化抑制により量の少ないペプチドが検出されにくい。そこで、ショットガンプロテオミクスを用いたタンパク質の同定効率改善を目的とし、分析化学的・情報学的手法を駆使して試料の濃度差および複雑性の問題を解決しようと試みてきた。これまで、メートル長モノリス型シリカカラムを用いたLCシステムでタンパク質消化試料を分析することで、分離能が格段に向上し、同定効率が著しく改善することを示してきた。研究実施状況本年度は、モノリス型シリカカラムを用いたLC-MS分析システムをヒト人工多能性幹細胞(hiPS細胞)およびヒト線維芽細胞へ応用した。ヒトiPS細胞5株および線維芽細胞3株のプロテオーム解析を行った結果、9510種のタンパク質を同定した。これは現在報告されているiPS細胞プロテオーム研究としては世界最大であり、既存の手法よりも必要試料量や測定時間を大幅に改善することに成功した。同定されたタンパク質のうち、約25%にあたる2366種のタンパク質はiPS細胞選択的に発現していた。特に転写制御に関わるタンパク質がiPS細胞選択的に発現しており、その中にはこれまでタンパク質レベルで存在が確認されていなかった転写制御機能を有する多能性マーカー候補タンパク質も含まれていた。この成果はヒトiPS細胞プロテオーム研究の第一歩となるものである。今後は、線維芽細胞の初期化過程などの得られる細胞が少ない状態でもプロテオーム解析を行うことのできる高感度な解析システムの開発、また、iPS細胞におけるリン酸化などの翻訳後修飾機能解析を集中的に行う必要があると考える。

Background タ ン パ ク に with fixed quantitative, qualitative を a net す る interstate に は, ナ ノ liquid ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー - quality analysis を (nanoLC - MS/MS) with い た シ ョ ッ ト ガ ン プ ロ テ オ ミ ク ス を with い る の が general で あ る. し か し, シ ョ ッ ト ガ ン プ ロ テ オ ミ ク ス に は main に の under two つ の problem point が あ り, sample の す べ て の タ ン パ ク qualitative を 1 degree に with fixed す る こ と は だ not difficult で あ る. : (1) the complex 雑 sex シ ョ ッ ト ガ ン プ ロ テ オ ミ ク ス で は sample in の タ ン パ ク qualitative を fragment the し て determination す る た め, try の material after 雑 が very high に く な る. There are approximately 30 million ペプチド fragments が students じると examination えられる. (2) the concentration difference: ヒ ト タ ン パ ク mass between の 発 amount is の は largest で 106 times あ り, poor 発 now quantity の が big き い タ ン パ ク qualitative origin の ペ プ チ ド が quality analysis meter に に play at the same time ち 込 ま れ る と, イ オ ン chemical inhibition に よ り fewer の な い ペ プ チ ド が 検 out さ れ に く い. そ こ で, シ ョ ッ ト ガ ン プ ロ テ オ ミ ク ス を with い た タ ン パ ク qualitative の be sharper rate improve を と し technique of information science, analytical chemistry, を 駆 make し て sample の concentration difference お よ び の を solve complex 雑 sex し よ う と try み て き た. こ れ ま で, メ ー ト ル long モ ノ リ ス type シ リ カ カ ラ ム を with い た LC シ ス テ ム で タ ン パ ク qualitative material を test analysis of digestive す る こ と で, separation can が に し upward, with constant working rate が the し く improve す る こ と を shown し て き た. Research be situation this year は, モ ノ リ ス type シ リ カ カ ラ ム を with い た LC - MS analysis シ ス テ ム を ヒ ト artificial pluripotent stem cells (hiPS) お よ び ヒ ト line d bud cells へ 応 with し た. ヒ ト iPS cells 5 strains お よ び line 3 d bud cell strains の プ ロ テ オ ー ム parsing line を っ た results, 9510 kinds of の タ ン パ ク qualitative を be し た. こ れ は now report さ れ て い る iPS cells プ ロ テ オ ー ム research と し て は the world's largest で あ り, existing の gimmick よ り も necessary to measure shoes や time を に significantly improve す る こ と に successful し た. With fixed さ れ た タ ン パ ク qualitative の う ち, about 25% に あ た る 2366 の タ ン パ ク qualitative は iPS cells sentaku に 発 now し て い た. Special に planning write suppression に masato わ る タ ン パ ク qualitative が iPS cells sentaku に 発 now し て お り, そ の in に は こ れ ま で タ ン パ ク qualitative レ ベ ル で exist が confirm さ れ て い な か っ た planning write suppression function を has す る pluripotency マ ー カ ー alternate タ ン パ ク qualitative も containing ま れ て い た. The first step of the <s:1> <s:1> research on iPS cells プロテ and ム is となる and である. Future は, line d bud cells during early の な ど の have ら れ る cells less が な い state で も プ ロ テ オ ー ム parsing line を う こ と の で き る Gao Gan degrees な parsing シ ス テ ム の 発, ま た, iPS cells に お け る リ ン acidification な ど の turn 訳 line modification after functional analytic を concentrated に う necessary が あ る と exam え る.

项目成果

複雑な試料成分の分析における高分離能の必要性について

复杂样品成分分析中对高分辨率的需求

• 发表时间: 2011
• 作者: 岩崎未央;石濱泰
• 通讯作者: 石濱泰

プロテオミクスLC-MSにおける挑戦

蛋白质组学 LC-MS 面临的挑战

• 发表时间: 2010
• 作者: 岩崎未央;冨田勝;石濱泰
• 通讯作者: 石濱泰

In-depth human proteome analysis by one-shot LC-MS/MS with meter-scale monolithic silica capillary columns

使用米级整体硅胶毛细管柱进行一次性 LC-MS/MS 进行深入的人类蛋白质组分析

• 发表时间: 2012
• 作者: 岩崎未央;若林真樹;杉山直幸;田中信男;石濱泰
• 通讯作者: 石濱泰

Toward complete coverage of human proteome by one-shot LC-MS/MS with meter-scale monolithic silica capillary columns

使用米级整体硅胶毛细管柱实现一次性 LC-MS/MS 完全覆盖人类蛋白质组

• 发表时间: 2012
• 作者: 岩崎未央;若林真樹;杉山直幸;田中信男;石濱泰
• 通讯作者: 石濱泰

大腸菌プロテオーム一斉解析システムの開発

大肠杆菌蛋白质组同步分析系统的研制

• 发表时间: 2011
• 作者: 岩崎未央;石濱泰
• 通讯作者: 石濱泰