NMRを用いた異常プリオンの構造解析とその多様性の評価

使用核磁共振对异常朊病毒进行结构分析并评估其多样性

• 批准号: 10J05602
• 负责人: 山口 圭一
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2010
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2010 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J05602/
• 关键词: プリオン; アミロイド線維; 核磁気共鳴; 緩和測定; 超音波; 超音波パワー; 伝播; アモルファス凝集体

異常プリオンPrp^<Sc>やプリオン蛋白質(PrP)のアミロイド線維は超分子複合体であり、非結晶性の凝集体であるので、通常の溶液NMRやX線結晶構造解析は適さない。そこで、(1)PrPアミロイド線維の重水素交換、(2)DMSOによる線維の可溶化、(3)NMRによる重水素交換の追跡、この一連の手法を用いてアミロイド線維内で水素結合を形成しているアミノ酸残基を特定することを目標に研究を行った。しかし、この手法ではDMSO溶液中でPrPのHSQCスペクトルを帰属する必要がある。現在、この帰属に難航しておりまだ実験が終わっていない。今後も引き続きHSQCスペクトルの帰属を行う、と同時にPrPアミロイド線維の構造情報をさらに得るため、PrPオリゴマーや断片化したアミロイド線維のNMRスペクトルの直接測定を行っていく予定である。一方、当研究室では正常PrPを安定化して、PrP^<Sc>への構造変換を抑制する低分子化合物の探索を行っている。そこで本研究では低分子化合物の添加によるPrPの揺らぎの抑制について調べた。まず、大腸菌の大量発現系により^<15>NラベルPrPを作製して、800MHz NMRを用いてT1,T2,NOEを測定した。その結果、低分子化合物Aの添加により、PrPのヘリックス2,3間のループ部分の揺らぎが抑えられる事が分かった。このようにPrPの揺らぎを制御することにより、PrP^<Sc>への構造変換を抑制することが可能であると考えられる。また、PrP^<Sc>の形成には"中間体"の存在が示唆されているがその構造は未だ不明である。そこで、高圧NMRを用いて天然状態から変性状態への連続的な構造変化を見ることによって、中間体の構造を明らかにすることを目的として実験を行った。その結果、pH3.0で2500atmまで加圧して、さらに0℃まで温度を下げることによりPrPがほぼ変性することが分かった。今後、PrPの天然状態→中間体→変性状態への圧力依存的構造変化を調べて中間体の構造を明らかにしたい。

Abnormal protein <Sc>(PrP) is characterized by X-ray crystallographic analysis of supramolecular complexes, amorphous aggregates, normal solution NMR and X-ray crystallographic structures. The purpose of this study is to investigate (1) the exchange of heavy hydrocarbons in PrP molecules,(2) the solubilization of heavy hydrocarbons in DMSO molecules,(3) the tracing of heavy hydrocarbons in NMR molecules, and the use of a series of methods to combine heavy hydrocarbons in PrP molecules to form specific acid residues in PrP molecules. This method is necessary to prepare PrP in DMSO solution. Now, this is a difficult time to navigate. In the future, HSQC will be used for direct determination of the structure information of PrP and line dimensions. In this paper, we explore the stability of PrP and the inhibition of structural transformation of PrP<Sc>. In this study, the addition of low molecular weight compounds to PrP and its inhibition were investigated. A <15>large number of E. coli strains were detected by T1,T2,NOE at 800MHz NMR. As A result, the addition of low molecular weight compound A, PrP, and PrP to the mixture of 2, 3 and 4 compounds was significantly reduced. The structure of PrP can be controlled by the following methods<Sc>: The formation of PrP^<Sc>indicates that the structure of PrP ^is unknown. High pressure NMR is used to determine the structure of the natural state and the intermediate state. As a result, pH 3.0 is 2500atm, and the temperature is 0℃. In the future, PrP's natural state → intermediate → variable state → pressure-dependent structure change → intermediate structure change →

项目成果

電界放出型透過電子顕微鏡によるアミロイド線維の観察

使用场发射透射电子显微镜观察淀粉样纤维

• 发表时间: 2012
• 作者: Takashi Kashimura;Ryota Watanabe;and Yoji Ohashi;山口圭一
• 通讯作者: 山口圭一

Estimation of ultrasonic power to induce the formation of amyloid fibril of mouse prion protein

诱导小鼠朊病毒蛋白淀粉样原纤维形成的超声功率估计

• 发表时间: 2011
• 作者: Ryota Watanabe;Shunji Tsuchiya;Yoji Ohashi;Kei-ichi Yamaguchi
• 通讯作者: Kei-ichi Yamaguchi

プリオン蛋白質のアミロイド線維形成を促進する超音波パワーの評価

超声功率促进朊病毒蛋白淀粉样原纤维形成的评价

• 发表时间: 2012
• 作者: Ryota Watanabe;Shunji Tsuchiya;Yoji Ohashi;Keiichi Yamaguchi;山口圭一
• 通讯作者: 山口圭一

Proper calibration of ultrasonic power enabled the quantitative analysis of the ultrasonication-induced amyloid formation process

• DOI: 10.1002/pro.755
• 发表时间: 2012-01-01
• 期刊: PROTEIN SCIENCE
• 影响因子: 8
• 作者: Yamaguchi, Kei-ichi;Matsumoto, Tomoharu;Kuwata, Kazuo
• 通讯作者: Kuwata, Kazuo

Estimation of ultrasonic power to induce the formation of amyloid fibrils of prion protein

诱导朊病毒蛋白淀粉样原纤维形成的超声功率估计

• 发表时间: 2013
• 期刊: 京都大学原子炉実験所KUR Report
• 作者: Tsushima K;Osawa T;Yanak H;Nakajima A;Takaoka A;Manabe I;Ohba Y;Imai Y;Taniguchi T;Nagai R;Yuji O. Kamatari;Kei-ichi Yamaguchi
• 通讯作者: Kei-ichi Yamaguchi