時間分割X線結晶構造解析による銅・トパキノン含有アミン酸化酵素反応機構の解明

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本研究では,アミン酸化酵素の反応機構の解明を目的に,反応に伴う構造変化を追跡した.土壌細菌由来アミン酸化酵素(AGAO)は,フェニルエチルアミンをフェニアルアセトアルデヒドとアンモニアに変換する酵素である.AGAOは基質を変換する還元的半反応において,各生物種由来酵素で研究が進められてきたが,反応制御の困難さから野生型酵素と真の基質を用いたより現実に近い条件での構造は解明されていなかった.以下に,研究成果を示す.1結晶中での反応時間の解明真の基質を導入した野生型AGAO結晶を用い,時間分割的に反応中間体捕捉結晶の調製を行った.各結晶をもとに,紫外可視領域における顕微分光測定を行うことで,結晶中での反応時間を見積もった.その結果,結晶中では2-60分の間で還元的半反応が進み溶液中での～6.0×10^4倍の反応時間がかかることを明らかにした.この結果は四次元構造解析に向けた基礎データとなるだけでなく,結晶場で束縛された条件における反応を考える上で重要な結果である.2四次元構造解析Michaelis complex,基質シッフ塩基,生成物シッフ塩基,酵素/生成物複合体の各反応中間体の構造決定に成功した.その結果,反応に伴うTPQ等のアミノ酸残基や水分子の配置に変化を見出し,既報の変異体利用の構造とは異なるものだった.また,酸素のプローブとしてキセノンを導入した複合体構造から,酸化的半反応の第一段階として,活性部位近傍に供給された酸素が銅を最初に酸化することが構造学的観点から示唆された.さらに,サブユニット間で反応の進度が異なり,分子パッキングにより基質チャネルの構造に差異が生まれ,活性部位への基質の到達に影響が出たためだと考えられた.本結果は,野生型酵素を用いて時間分割的な反応中間体の構造変化を追跡することで真実により近い反応機構の解明に繋がるとともに,触媒反応が酵素全体で協調的に制御されていることの理解へ繋がった.