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時間分割X線結晶構造解析による銅・トパキノン含有アミン酸化酵素反応機構の解明

通过时间分辨 X 射线晶体结构分析阐明铜和托帕醌胺氧化酶的反应机制

基本信息

批准号：
10J07922
负责人：
片岡未有
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kwansei Gakuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10J07922/
关键词：
アミン酸化酵素 X線結晶構造解析トパキノン金属酵素反応中間体

项目摘要

本研究では,アミン酸化酵素の反応機構の解明を目的に,反応に伴う構造変化を追跡した.土壌細菌由来アミン酸化酵素(AGAO)は,フェニルエチルアミンをフェニアルアセトアルデヒドとアンモニアに変換する酵素である.AGAOは基質を変換する還元的半反応において,各生物種由来酵素で研究が進められてきたが,反応制御の困難さから野生型酵素と真の基質を用いたより現実に近い条件での構造は解明されていなかった.以下に,研究成果を示す.1結晶中での反応時間の解明真の基質を導入した野生型AGAO結晶を用い,時間分割的に反応中間体捕捉結晶の調製を行った.各結晶をもとに,紫外可視領域における顕微分光測定を行うことで,結晶中での反応時間を見積もった.その結果,結晶中では2-60分の間で還元的半反応が進み溶液中での～6.0×10^4倍の反応時間がかかることを明らかにした.この結果は四次元構造解析に向けた基礎データとなるだけでなく,結晶場で束縛された条件における反応を考える上で重要な結果である.2四次元構造解析Michaelis complex,基質シッフ塩基,生成物シッフ塩基,酵素/生成物複合体の各反応中間体の構造決定に成功した.その結果,反応に伴うTPQ等のアミノ酸残基や水分子の配置に変化を見出し,既報の変異体利用の構造とは異なるものだった.また,酸素のプローブとしてキセノンを導入した複合体構造から,酸化的半反応の第一段階として,活性部位近傍に供給された酸素が銅を最初に酸化することが構造学的観点から示唆された.さらに,サブユニット間で反応の進度が異なり,分子パッキングにより基質チャネルの構造に差異が生まれ,活性部位への基質の到達に影響が出たためだと考えられた.本結果は,野生型酵素を用いて時間分割的な反応中間体の構造変化を追跡することで真実により近い反応機構の解明に繋がるとともに,触媒反応が酵素全体で協調的に制御されていることの理解へ繋がった.

In this study, we aim to elucidate the mechanism of the enzyme and trace its structure. Soil bacteria derived aminolytic enzyme (AGAO) is an enzyme that changes the amino acid from amino acid to amino acid.AGAO is a semi-reaction that changes the substrate. Research on enzymes derived from various biological species has been advanced, and the difficulty of reaction control has been solved since wild-type enzymes can be used in real substrates. However, the structure of the present near-ideal conditions has been clarified. The results of the study are shown below. 1. The introduction of the substrate for the resolution of the time domain in crystallization, the use of the wild-type AGAO crystal, and the modulation of the capture crystal for the time domain intermediate. Each crystal is visible in the ultraviolet field, and the differential light measurement is performed in the crystal. As a result, the crystallization time is 2-60 minutes, the semi-reaction time is ~6.0×10^4 times, and the reaction time is ~6.0×10^4 times. The results are important for the analysis of quaternary structure. 2. The analysis of quaternary structure is successful in determining the structure of Michaelis complex, matrix, product, enzyme/product complex and their intermediates. As a result, the structure and structure of heterogenous utilization of TPQ and other amino acid residues and water molecules were reported. The acid element is introduced into the complex structure, and the acid element is supplied near the active site. The acid element is introduced into the complex structure, and the acid element is supplied to the copper element. In addition, the progress of the reaction between the two molecules is different, and the structure of the matrix is different, and the active site is affected by the matrix. The results showed that the structure of the intermediate of the wild-type enzyme was characterized by time division, and the structure of the intermediate of the catalytic enzyme was characterized by time division.