生合成酵素を用いたテルペノイドの酵素的全合成とゲノム科学的新奇生合成遺伝子の探索

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前年度の研究により10種類以上の組換え酵素を組み合わせたテルペノイドの試験管内合成系を確立し、単純な出発原料から生理活性テルペノイドの全合成に成功していた。ゲノム情報が公開されたシダ植物S.moellendorffiiのゲノム中に見出された新奇ジテルペン環化酵素に関して機能解析を行った。この遺伝子をcDNAライブラリーからクローニングし、大腸菌を用いて組換え酵素の生産と精製を行った。得られた組換え酵素をテルペノイド試験管内合成系に加え、環化反応生成物の合成を行った。酵素反応生成物をGC-MSで分析したところ、目的化合物の合成が確認された。酵素合成の出発原料に完全^<13>C標識化合物を用いることで生成物の炭素を全て^<13>Cで標識化しNMRによる測定感度の向上を試みた。酵素合成系の出発原料に完全^<13>C標識メバロン酸を用いて約1mgの酵素反応生成物を調製した(収率約26%)。この完全13C標識生成物を^<13>C-NMRを基本とする各種NMR解析に供した。同種核2次元NMRの^<13>C-^<13>C COSY測定を行い、隣接する炭素同士の結合を直接クロスピークから読み取ることで、平面構造の大部分を決定した。ピークが重なり解析が困難だった部分に関しては、3次元NMRによってピークを分離し、解析を行った。その結果、生成物をミルティラジエンであると決定した。さらに、糸状菌に特異的に分布しているキメラ型ジテルペン環化酵素の機能解析にも取り組んだ。機能未知遺伝子をクローニングし、ミルティラジエン合成酵素と同様に解析を行ったところ、化合物の平面構造の決定に成功し、新規化合物であることが判明した。遺伝子の構造が異なる二種類生合成酵素の機能解析にも成功し、酵素合成系と安定同位体標識化、多次元NMRを組合せた本手法はテルペノイド生合成酵素機能解析法として非常に強力である事を示した。