体細胞核移植クローン技術を用いたヒトてんかん責任遺伝子改変モデルラットの作成

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先にDravet症候群患者で直接シークエンス法で同定したGABA_A受容体γ2サブユニットをコードするGABRG2遺伝子におけるナンセンス変異であるp.R40X変異を海馬由来初代培養神経細胞に導入し、細胞内局在を抗γ2サブユニット抗体用いて蛍光免疫染色で観察した。γ2サブユニットは野生株では細胞体、樹状突起、軸索末端迄出現していたが、変異導入細胞では軸索末端への分布は減少していた。同時にα1、β2の各サブユニットの分布を観察したが、両者共に軸索への分布は減少していた。また、小胞体マーカーとしてカルネキシン、ゴルジ装置マーカーとしてGM130とp115を用い二重染色し、変異導入細胞ではカルネキシンとα1、β2サブユニットが同じ局在であり小胞体内にα1、β2が蓄積していた。これは、先にHEK293細胞で観察した結果と同様であり、神経細胞でもGABRG2変異(R40X)はGABA_A受容体を小胞体内に蓄積し、軸索末端への細胞内輸送を阻害するドミナント・ネガティブ効果を示した。また、同じGABRG2遺伝子で直接シークエンス法でp.N40Sのミスセンス変異を全身性強直間代性けいれん患者で同定した。GABRG2遺伝子の変異は他に素因性てんかん熱性けいれんプラス(genetic epilepsy with febrile seizures plus: GEFS+)で同定されており遺伝子型と表現形の関連性が以前不明瞭であったが、今年度の結果より細胞内輸送の異常が表現形に影響することが神経細胞でも証明され、モデル動物でもヒトと同じ表現形をとると期待できる結果を得た。同時に、新たにCa^<2+>チャネルをコードするCACNA1AとCACNA1B遺伝子を難治性特発性てんかんに対して直接シークエンス法にて変異を探索しており遺伝子異常が見出された際は、イオンチャネルを標的としたヒトてんかんモデルラット作製が可能となる。