アネキシンA5LacZノックインマウスを用いた歯周組織幹細胞の同定と機能解析

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本研究は 歯周組織においてBrduラベル長期保持細胞が組織再生過程で機能し、annexin A5を発現するペリサイトpericyteの性格をもつ幹細胞である、という仮説をノックインマウスを用いて解析することを目的としている。困難であった、Brdu LacZの組織での共局在解析が本研究で開発した低温アセトン固定法により可能となった。この技術を用い、Brduラベル長期保持細胞(LRCs)の局在がannexin A5陽性細胞(LacZ発現細胞)と重なるかどうか解析したところ、LacZ陽性細胞の一部はBrduラベル長期保持細胞であり、静止型幹細胞の性質を保持することが示唆された。annexin A5陽性の歯周組織細胞を回収するための実験として、FACS sortingを行う計画を立案したが、予備検討では10x 5乗オーダーの歯根膜細胞が必要であった。一方従来用いられてきた、コラゲナーゼ処理によって細胞を回収するアプローチだけでは、十分な細胞数を確保することが困難であることがわかった。そこで従来の方法を改良し、新たなコラーゲンゲル培養法を開発した。すなわち抜去した歯を歯根膜がついたままゲル上のコラーゲンに入れ、3次元培養でしばらく培養し、その上でコラゲナーゼ処理後細胞を回収した。さらに細胞を単層培養で増やした後に回収した。細胞のコロニー形成能と増殖能を調べたところ、ゲル内で培養することによってそれらの値が著明に増加し、回収できる細胞数も増加した。さまざまな遺伝子発現レベルでチェックしたところ、歯周組織や間葉系幹細胞のマーカーの発現が認められた。annexin A5-LacZノックインマウス由来の細胞についても同様に調べたところ、回収した幹細胞を含む細胞の中にLacZ陽性細胞が多数含まれていることがわかった。