新規発現プロフィール法を用いた骨格原基の細胞凝集形成に関わる新規遺伝子の単離

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本研究では、骨格原基において細胞凝集塊形成に関わる新規分子を単離することを目的とした。そのために新規高精度発現プロフィール法(HiCEP法)を応用し、in vivoの微量な細胞凝集塊組織における網羅的な遺伝子発現解析を行うアプローチを確立した。まず発現変動が認められる転写産物を網羅的にピックアップし、その上で転写産物の同定を行った。微量RNA(約10ng)をもとにHiCEP反応を行うため、従来のHiCEP反応を改良し、固相での酵素反応を行った。それにより約3万の転写産物のプロファイルを解析し、発現量に変化の認められた転写産物が約400種類得られた。それらの遺伝子の同定を行った。HiCEP反応後、変動パターンから選定した転写産物をゲルから抽出、PCR増幅した後、ダイレクトシークエンスによって配列決定した。目的とする転写産物についてデーターベースで相当するものが得られなかったものについては、両端に多数種類のspecificprimerを設計し、PCR増幅したのちそれぞれに対してシークエンスを行った。さらに、一部は転写産物をユニバーサルプライマーにてPCR増幅したものを、クローニングベクターにサブクローニングし、大腸菌のコロニーからダイレクトシークエンスを行って配列決定した。これらにより約300の遺伝子配列を同定した。また、それらが細胞凝集に伴って発現変動が認められるか確認するために、Embryonic cay11.5の肢芽を用いた細胞凝集再構成を行い、RNA抽出後real time PCRを行った。多くの遺伝子産物が凝集形成に伴って発現変動することを確認した。