新規抗動脈硬化症薬開発を指向した脂質輸送担体の分解を司るユビキチンリガーゼの探索

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本研究では、ABCA1の細胞膜上でのユビキチン化を制御しているユビキチンリガーゼの同定が目標としている。昨年度の細胞膜上ABCA1のユビキチン化を指標としたスクリーニングによって絞り込まれた4つの候補ユビキチンリガーゼの詳細な解析に取り組んだ。一方、ユビキチンリガーゼの探索に平行して、細胞膜上ABCA1のユビキチン化に起因するリソソームでの分解経路の生体のでの重要性を検討すべく、ABCA1のユビキチン化に変化を与えるパーターベーションを探索も行っていた。結果、ヒト肝癌由来の培養細胞、HepG2細胞や、マウス腹腔マクロファージにおいて、脂質蓄積時や過剰なコレステロールより産生されるオキシステロールをリガンドとするLXRbを活性化することでABCA1のUb化が上昇し、細胞膜上からの分解速度が上昇することを見出した。通常状態よりもLXRb活性化状態の方がユビキチン化制御の効果が検出しやすいと考え、HepG2細胞に対してLXRリガンドを処理した条件下にて、s iRNAを用いた候補ユビキチンリガーゼのノックダウンを行い、その細胞膜上ABCA1の発現量を評価した。結果、一つのユビキチンリガーゼをノックダウンした際に発現量増加が認められた。以降、このユビキチンリガーゼをE3-Xと呼称する。E3-Xは通常状態では細胞膜上ABCA1の分解速度に影響を与えなかった一方、LXRリガンド処理下で分解を抑制することが明らかとなり、またこのときABCA1のコレステロール排出機能上昇も確認された。免疫沈降法による相互作用試験の結果、COS1細胞に対し強制発現させたE3-XとABCA1は相互作用することがわかった。さらに同じ強制発現系において免疫染色法による局在解析を行ったところ、E3-Xは細胞膜上、あるいは細胞膜近傍の領域でABCA1と共局在していることがわかった。全反射顕微鏡を用いた局在解析においても同様に共局在が認められたので、E3-XとABCA1は少なくとも細胞膜上、あるいはその近傍において共局在しているものと推察される。