Determining the Domain Linkages in the Myosin Motor

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Muscle contraction comes about through a cyclical interaction between the myosin cross-bridge and the action filament. The cycle is driven by ATP hydrolysis. The myosin cross bridge has two important functions: to bind and release from the actin filament and to execute the "power stroke" which pushes the actin filament past the anchored cross bridge. The power stroke is accomplished by the rotation of a long lever arm from a "pre-power stroke" to a "post-power stroke" configuration. Both the pre-power stroke and post-power stroke forms of the myosin cross bridge have been extensively characterised by protein crystallography. The binding to actin can be "weak" or "strong", which is controlled by ATP binding. Recent high resolution cryo-em studies in our labatory have led to a model of the weak-strong transition and an understanding of the mechanism by which ATP binding and actin binding are linked. This arose through the closing of the "deep cleft" in the cross bridge. However, until now only the cleft-open form has been found. We now wish to identify point mutants leading to cleft-closed cross bridges and to characterise these by X-ray crystallography and electron microscopy. Zusammenfassung: Muskeln kontrahieren auf Grund der zyklischen Wechselwirkung zwischen der Myosin-Querbrücke und dem Aktinfilament. Der Zyklus wird durch ATP-Hydrolyse verursacht. Die Myosin-Querbrücke hat zwei wichtige Funktionen: Anbindung an das und Lösung vom Aktinfilament sowie Ausführung des "Power Stroke", der das Aktinfilament an der verankerten Querbrücke vorbeischiebt. Die Rotation eines langen Hebelarms von der "Vor-Power-Stroke" zur "Nach-Power-Stroke" Stellung bewirkt diesen Power-Stroke. Beide Stellungen der Myosin-Querbrücke sind mit Hilfe der ProteinKristallographie ausführlich charakterisiert worden. Je nach ATP-Bindung kann die Bindung an Aktin "schwach" oder "stark" sein. Auf Grund unserer jüngsten hochauflösenden Cryo-EM-Untersuchungen haben wir eine Modell entwickelt zur Erklärung des Übergangs von "schwach" zu "stark" sowie für den Mechanismus, der die ATP-Bindung mit der Aktin-Bindung koppelt, indem sich nämlich die "Kluft" in der Querbrücke schließt. Allerdings haben wir bisher nur die Form mit der "offenen Kluft" gefunden. Wir haben jetzt vor, Punktmutanten zu finden, die zu Querbrücken mit "geschlossener Kluft" führen und diese dann mit Hilfe von Röntgenkristallographie und Elektronenmikroskopie zu charakterisieren.