発生工学プロテオミクスを用いた胸腺特異的ユビキチンリガーゼの機能解析

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前年度までに、「インタラクション・プロテオミクス法」の改良(用いる細胞株の変更や遺伝子導入法の検討)を行うことで、新たなFbxl12の基質候補を同定した。これを受け、まず培養細胞レベルでのこの基質候補に対する同様の評価実験をHEK293T細胞から急性リンパ性白血病由来のJurkat細胞へと系を移して行った。しかしながら、Fbxl12ノックダウン条件において、この基質候補の有意な蓄積が認められず、タンパク半減期の遅延も認められないことが明らかとなった。更に、発現量に関する解析の結果、この新規基質候補の発現が造血幹細胞からリンパ球系細胞への分化にかけて非常に低いということが明らかとなった。この結果を受け、「インタラクション・プロテオミクス法」の改良に加えて、Fbxl12KOマウスとiTRAQ法を用いた、「リバース・プロテオミクス法」による新規基質の探索を現在試みている段階である。前段階の実験結果として、幾つかの可能性のある因子を同定することに成功しており、「リバース・プロテオミクス法」の結果の再現性を得る実験と同時に並行して基質候補として同定されたものについて、WTとFbxl12KOマウスの胸腺組織を用いた解析を行っている。具体的には、基質遺候補伝子の定現量や発現部位の変化を解析すること、Fbxl12KOマウスの胸腺組織細胞でのRNAiによる下流遺伝子の安定性に対する表現型改善の有無やFACSによるT細胞の系譜の変化等を解析すること等を試みている。