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発生工学プロテオミクスを用いた胸腺特異的ユビキチンリガーゼの機能解析

使用发育蛋白质组学对胸腺特异性泛素连接酶进行功能分析

基本信息

批准号：
11J03061
负责人：
山内隆好
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J03061/
关键词：
ユビキチン F-boxタンパク質プロテオミクスユビキチン化酵素

项目摘要

前年度までに、「インタラクション・プロテオミクス法」の改良(用いる細胞株の変更や遺伝子導入法の検討)を行うことで、新たなFbxl12の基質候補を同定した。これを受け、まず培養細胞レベルでのこの基質候補に対する同様の評価実験をHEK293T細胞から急性リンパ性白血病由来のJurkat細胞へと系を移して行った。しかしながら、Fbxl12ノックダウン条件において、この基質候補の有意な蓄積が認められず、タンパク半減期の遅延も認められないことが明らかとなった。更に、発現量に関する解析の結果、この新規基質候補の発現が造血幹細胞からリンパ球系細胞への分化にかけて非常に低いということが明らかとなった。この結果を受け、「インタラクション・プロテオミクス法」の改良に加えて、Fbxl12KOマウスとiTRAQ法を用いた、「リバース・プロテオミクス法」による新規基質の探索を現在試みている段階である。前段階の実験結果として、幾つかの可能性のある因子を同定することに成功しており、「リバース・プロテオミクス法」の結果の再現性を得る実験と同時に並行して基質候補として同定されたものについて、WTとFbxl12KOマウスの胸腺組織を用いた解析を行っている。具体的には、基質遺候補伝子の定現量や発現部位の変化を解析すること、Fbxl12KOマウスの胸腺組織細胞でのRNAiによる下流遺伝子の安定性に対する表現型改善の有無やFACSによるT細胞の系譜の変化等を解析すること等を試みている。

In the past year, the improvement of the method of "selecting genes from different cell lines" was carried out, and the matrix candidate of new Fbxl12 was also determined. This is the case with HEK293 T cells and Jurkat cell lines derived from acute leukemia. Fbxl12 is a matrix candidate for intentional accumulation. In addition, the results of analysis related to the amount of expression, the expression of new matrix candidates, the differentiation of hematopoietic stem cells and hematopoietic lineage cells, are very low. The results show that the improvement of the method, the application of the Fbxl12 KO method and the iTRAQ method, the exploration of the new matrix and the current trial stage. The results of the previous stage were determined by the probability factor, and the reproducibility of the results was determined by the matrix candidate method. WT Fbxl12KO was used to analyze the thymus tissue. FACS was used to analyze the phenotype improvement, the presence or absence of RNAi in thymic tissue cells, the stability of downstream genes, and the transformation of T cells.