テロメア特異的蛋白質複合体シェルタリンによるテロメラーゼの制御機構解明

阐明端粒特异性蛋白复合物庇护蛋白对端粒酶的控制机制

• 批准号: 11J06488
• 负责人: 大谷 淳二
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2011
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2011 至 2012
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J06488/
• 关键词: テロメア; X線結晶構造解析; ヒドロキシメチルシトシン; DNA脱メチル化

前年度までに、分裂酵母のテロメラーゼ制御において重要な蛋白質である、Ccq1の493-735アミノ酸の領域の蛋白質結晶を調製する事に成功していたため、本年度は、X線データの位相情報を得ることを目指し、重原子置換体結晶の調製に取り組んだ。しかし、蛋白質の結晶化実験の再現性が悪いことが問題となった。そこで、表面残基エントロピー減少法(SERp server)を用いて蛋白質表面にアミノ酸変異を導入した所、再現性よく、同型の結晶が得られるようになった。さらに得られた結晶は、元の野生型の蛋白質を用いて得られていた結晶よりも対称性が高く、X線回折強度データの精密な測定が必要になる位相決定に有利なものとなっていた。今後、これらの変異体結晶を用いて結晶構造解析を進める。また、先行研究の結果などから、ヒトなどの高等真核生物において、シェルタリン蛋白質、TPP1のリン酸化依存的な二量体化がテロメア伸長に重要であるとの仮説を立て、それを立証するための実験を行った。293T細胞において、FLAGタグ融合およびHAタグ融合TPP1蛋白質を強制発現し、免疫沈降実験を行った。この実験から、二種のタグが融合された蛋白質どうしの相互作用が検出され、TPP1が実際に多量体化していることが示唆された。ところが、予想される二量体表面のアミノ酸残基に種々の変異を導入しても、この相互作用を壊す事ができないことから、TPP1は予想された二量体結合表面を介して結合しているのではないことが示唆された。本年度の研究によって予想された形式での多量体化はみられなかったものの、TPP1どうしの相互作用が確認された。この相互作用の生物学的意義については引き続き検討したい。

Protein crystal of the previous year, fission yeast and fission yeast important protein, Ccq1 493-735 アミノ acid fieldをThe success of the する事にしていたため, this year's は, the X-ray データのphase information をget ることを Eye finger, the heavy atom substitution crystal のmodulation り group んだ. The problem of protein crystallization and reproducibility is also a problem.そこで, surface residue reduction method (SERp Server) is used to introduce the protein surface acid and isoforms, reproducibility, and homogeneous crystallization. The original wild-type protein has high symmetryく, X-ray refraction strength is necessary for precise measurement and phase determination is advantageous. From now on, we will continue to analyze the crystal structure of これらの変variant crystals.また, results of preliminary research などから, ヒトなどのHigher eukaryotes において, シェルタリン protein, TPP1 のリンAcidification-dependent な 二quantification がテロメアelongation に であるとの仮说 を立て、それを立证するための実験を行った. 293T cells において, FLAG fusion およびHA タグ fusion TPP1 protein を forced appearance し, immune sedimentation 実験を行 った.この実験から、 Two kinds of のタグが fusion されたprotein どうしのinteraction が検出され、TPP1が実记に多体　　　　　　　　　　　ところが, yu want to される binary surface のアミノacid residue にkind 々の変different を introduction しても, このinteraction を壊す事ができないことから, TPP1は yu want to された Two-dimensional body combined surface を mediated し て combined し て い る の で は な い こ と が 见唆 された. This year's research is based on the idea of ​​​​confirming the interaction of TPP1 and the multi-volume bodyization of the form. The biological significance of このinteraction is the meaning of interaction.

项目成果

Quantitative comparison of protein dynamics in live cells and in vitro by in-cell (19)F-NMR.

• DOI: 10.1039/c3cc39205h
• 发表时间: 2013-03
• 期刊: Chemical communications
• 影响因子: 4.9
• 作者: Yousuke Takaoka;Y. Kioi;A. Morito;Junji Otani;K. Arita;E. Ashihara;M. Ariyoshi;H. Tochio;M. Shirakawa;I. Hamachi

Structural Basis of the Versatile DNA Recognition Ability of the Methyl-CpG Binding Domain of Methyl-CpG Binding Domain Protein 4

• DOI: 10.1074/jbc.m112.431098
• 发表时间: 2013-03-01
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Otani, Junji;Arita, Kyohei;Shirakawa, Masahiro
• 通讯作者: Shirakawa, Masahiro

Hinge and chromoshadow of HPlα participate in recognition of K9 methylated histone H3 in nucleosome.

HPlα 的铰链和染色体阴影参与核小体中 K9 甲基化组蛋白 H3 的识别。

• 发表时间: 2013
• 期刊: Journal of Molecular Biology
• 影响因子: 5.6
• 作者: Otani J;Kimura H;Sharif J;Endo TA;Mishima Y;Kawakami T;Koseki H;Shirakawa M;Suetake I;Tajima S;Mishima Y
• 通讯作者: Mishima Y

Cell cycle-dependent turnover of 5-hydroxymethyl cytosine in mouse embryonic stem cells.

• DOI: 10.1371/journal.pone.0082961
• 发表时间: 2013
• 期刊: PloS one
• 影响因子: 3.7
• 作者: Otani J;Kimura H;Sharif J;Endo TA;Mishima Y;Kawakami T;Koseki H;Shirakawa M;Suetake I;Tajima S
• 通讯作者: Tajima S