共鳴ラマン分光法によるチトクロムc酸化酵素のプロトンポンプ機構の解明

使用共振拉曼光谱阐明细胞色素 C 氧化酶的质子泵机制

基本信息

批准号：
11J07254
负责人：
坂口美幸
金额：
$ 0.83万
依托单位：
University of Hyogo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2012
项目状态：
已结题

项目摘要

チトクロムc酸化酵素(CcO)はミトコンドリア呼吸鎖の末端酸化酵素であり、分子状酸素(O_2)の還元反応と共役したプロトンポンプを行う。CcOは、真核生物ではミトコンドリア内膜に、好気性細菌では細胞膜に存在し、膜を介した電気化学ポテンシャルを形成する事でATPの合成を駆動する。CcOの活性中心であるヘムaは、プロトンポンプの駆動部位として機能するが、共鳴ラマンスペクトルではヘムの振動モードを選択的に共鳴増大し、その構造情報を得る。本研究では、プロトンポンプと連動して構造変化すると推測されている、ヘムaの側鎖7位プロピオン酸基とヒドロキシファルネシルエチル基に由来する振動モードの帰属決定を行い、プロトンポンプに伴った構造変化を検出する事を目的とした。そして細菌CcOの変異型酵素を調製し、その共鳴ラマンスペクトルを解析する事で、364cm^<-1>と1251cm^<-1>にそれぞれ7位プロピオン酸基とヒドロキシファルネシルエチル基に由来する振動モードを帰属した。また、ヘムヨが駆動するプロトンポンプ機構は哺乳類(ウシ心筋)酵素において提案されているので、細菌CcOの帰属を基に、ウシ心筋CcOの共鳴ラマンスペクトルを解析し、7位プロピオン酸基とヒドロキシファルネシルエチル基に由来する振動モードを370cm^<-1>と1251cm^<-1>に帰属した。そして酵素反応追跡用人工心肺装置を用いて、CcOのO_2還元反応の時間分解共鳴ラマンスペクトルを測定した。この時間分解測定は条件検討の段階である。これまで、プロトンポンプに伴うヘムやタンパク質の構造変化が、実時間で検出された報告は無かった。本研究で帰属したヘムa側鎖の振動モードはプロトンポンプに伴う構造変化を反映するため、時間分解測定のマーカーバンドとしての利用が期待される点で意義があり、動的プロトンポンプ機構解明のための基礎を与える点で重要である。

细胞色素C氧化酶（CCO）是线粒体呼吸链的末端氧化酶，并经过与分子氧还原反应结合的质子泵（O_2）。 CCO存在于真核生物的线粒体内膜中，有氧细菌中存在CCO，并通过通过膜形成电化学电位来驱动ATP的合成。血红素A（CCO的活性中心）充当质子泵的驱动位点，但是在共振拉曼光谱中，血红素的振动模式选择性地增加，获得结构信息。在这项研究中，我们确定了源自血红素A侧链的第7位丙酸酯基团和羟基法尼甲基甲基的指定振动模式，估计它们与Proton泵结构结构变化，目的是检测与Proton泵相关的结构变化。然后制备细菌CCO的突变酶，并分析共振拉曼光谱，分别分配源自丙酸酯基团和羟基甲基甲基甲基的振动模式，分别在第7位，分别为364cm^<-1>> <-1>和1251cm^<-1>。 Furthermore, since hemuyo-driven proton pump mechanisms have been proposed in mammalian (bovine myocardial) enzymes, the resonance Raman spectra of bovine myocardial CcO were analyzed based on the assignment of the bacterial CcO, and vibrational modes derived from the 7th-position propionate group and hydroxyfarnesilethyl group were assigned to 370 cm^<-1>和1251 cm^<-1>。然后，使用人工心肺机器来测量CCO的O_2还原反应的时间分辨共振拉曼光谱，以跟踪酶反应。该时间分辨的测量正处于条件考虑的阶段。到目前为止，尚未报道过与质子泵相关的血红素或蛋白质的结构变化的实时检测。分配给这项研究的血红素A侧链的振动模式反映了与质子泵相关的结构变化，并且有意义的是，预计它将用作时间分辨测量值的标记带，并且很重要，因为它为阐明动态质子泵的机制提供了基础。

项目成果

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チトクロムc酸化酵素におけるヘムa側鎖ヒドロキシファルネシルエチル基の共鳴ラマン線

细胞色素c氧化酶血红素a侧链羟基法呢基乙基的共振拉曼线

DOI：
发表时间：
2012
期刊：
影响因子：
0
作者：
坂口美幸;片山幸江;藤井浩;島田秀夫;小倉尚志
通讯作者：
小倉尚志

Tuning the geometries of a de novo blue copper protein by axial interactions

通过轴向相互作用调整从头蓝铜蛋白的几何形状

DOI：
10.1007/s00775-012-0916-x
发表时间：
2012
期刊：
Journal of Biological Inorganic Chemistry
影响因子：
3
作者：
Daigo Shiga;Yusuke Hamano;Misato Kamei;Yasuhiro Funahashi;Hideki Masuda;Miyuki Sakaguchi;Takashi Ogura and Toshiki Tanaka
通讯作者：
Takashi Ogura and Toshiki Tanaka

Non-innocent ligand behaviour of a bimetallic Cu complex employing a bridging catecholate

使用桥联儿茶酚盐的双金属铜络合物的非无害配体行为

DOI：
10.1039/c2dt30444a
发表时间：
2012
期刊：
Dalton Transactions
影响因子：
4
作者：
Tim J. Dunn;Linus Chiang;Caterina F. Ramogida;Mike I. Webb;Didier Savard;Miyuki Sakaguchi;Takashi Ogura;Yuichi Shimazaki and Tim Storr
通讯作者：
Yuichi Shimazaki and Tim Storr

レスティング酸化型チトクロムc酸化酵素の酸素還元部位の配位構造

静止氧化细胞色素c氧化酶氧还原位点的配位结构