in-cell 高感度一分子構造ダイナミクス解析システムの開発

细胞内高灵敏度单分子结构动力学分析系统的开发

• 批准号: 22K05018
• 负责人: 坂口 美幸
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Saitama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05018/
• 关键词: 細胞内分光計測; 蛍光相関分光法; 生体高分子; 蛍光寿命相関分光法; 細胞内計測; 構造ダイナミクス

細胞内では、核酸やタンパク質、脂質などの生体高分子が混雑して存在し、互いに相互作用する中でその機能を発現している。一分子分解能で計測したデータから得られる生体高分子の構造ダイナミクスは分子物性を反映するが，これまでほとんどの研究はin vitroにおいて為されてきた．本研究では，細胞内環境において生体高分子の詳細な物性解析を可能にする，高感度の一分子計測システムの開発を目指す．この目的のもと，in vitroにおいてマイクロ秒の高い時間分解能で構造不均一性を検出することが既に報告されている二次元蛍光光寿命相関分光法を，細胞内計測に応用する．初年度は新たに細胞実験を行う環境を構築する必要があった．そこで，細胞を取り扱っている研究室で培養方法を学んで情報を収集し，必要な装置や消耗品を購入し準備を進めた．また細胞へ導入する予定の生体高分子である蛍光色素標識したDNA鎖を入手し，予め二次元蛍光寿命相関分光法によりin vitroにおいて構造ダイナミクスの解析を行った．二次元蛍光光寿命相関分光法を行うための蛍光寿命相関分光装置は，in vitroの系で最適化されていたため，細胞内計測に応用するための改良を行った．また蛍光タンパク質を導入した細胞を入手し改良した装置で計測することで，細胞内計測における問題点を調査した．その結果，蛍光タンパク質以外のバックグラウンドに由来する信号が見られたため，これを除去する解析法の検討を行った．尚，初年度は８月末から３月末までの間産後休暇及び育児休暇を取得したため，その間研究は中断した．

在细胞内部，生物聚合物（例如核酸，蛋白质和脂质）以拥挤的方式存在，它们的功能是通过相互作用来表达的。从单分子分辨率测得的数据获得的生物聚合物的结构动力学反映了分子特性，但大多数研究都是在体外进行的。这项研究旨在开发高度敏感的单分子测量系统，该系统能够在细胞内环境中详细的生物聚合物物理特性。为此，我们将二维荧光寿命相关光谱应用于据报道以高微秒的体外分辨率检测结构异质性，以在细胞内测量。在第一年，有必要为进行细胞实验创建一个新的环境。因此，他们学会了如何在处理细胞，收集信息，购买必要的设备和消耗品并进行准备的实验室中培养细胞。此外，获得了荧光标记的DNA链，即计划在细胞中引入的生物聚合物，并通过二维荧光寿命相关光谱谱在体外分析结构动力学。在体外系统中优化了用于执行二维荧光寿命相关光谱的荧光寿命相关光谱，因此，对细胞内测量进行了改进的应用。此外，通过获得荧光蛋白引入的细胞并使用改进的装置来测量它们，研究了细胞内测量的问题。结果，发现了源自荧光蛋白以外的其他背景的信号，并研究了一种分析方法以将其去除。此外，在第一年，在8月底至3月底之间，在第一年和育儿休假休假，因此该研究在那段时间被暂停。