ペプチド鎖間にＳＳ結合を有するインスリンの効率的なフォールディング手法の開発

肽链间SS键胰岛素高效折叠方法的开发

• 批准号: 12J10124
• 负责人: 荒井 堅太
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tokai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J10124/
• 关键词: インスリン; リラキシン; フォールデイング; ジスルフィド結合; ペプチド合成; SS結合; 鎖間SS架橋法; 酸化的フォールディング; DHS^<ox>; 反応速度論解析

本研究はペプチド鎖間ジスルフィド(SS)架橋法によって天然型インスリの簡便且つ効率的な酸化的フォールディング手法を確立することを目的としている。平成25年度は交付申請書に記載した「研究の目的」に従い、(1)インスリンA鎖およびB鎖を用いたペプチド鎖間SS架橋法によるフォールディング収率の向上を目指した反応条件の検討、(2)インスリンに対して最適化した反応条件の二本鎖ペプチドホルモン、リラキシンへの適用を主要課題として設定し、研究を行った。(1)の研究課題は交付申請書「研究実施計画」に従って実験を行い、天然型インスリンを高収率で得る為、フォールディング反応の条件検討を行った。フォールディング収率だけでなく反応過程における中間体の生成量に基づいて、温度、pH、添加剤などの条件を緻密に検討し、最適化を行った。結果として、はじめにインスリンA鎖の分子内SS結合を一部架橋し、次に還元型のインスリンB鎖を添加することで分子間SS架橋反応が効果的に促され、良好な収率で天然型のインスリンが得られた。さらに低温、弱塩基性条件下で収率の向上が見られた。また、添加剤として複数のヒドロキシ基を有する水溶性添加剤を適当量加えることで収率をさらに改善することができた。添加剤の作用機序については現在検証中である。現在インスリンのフォールディング収率は35～40%を達成している。続いて課題(2)では、インスリンで最適化した反応条件と同様のものをリラキシンにも応用した。結果的に天然型リラキシンをフォールディング収率45～70%で得ることができ、過去の報告と比較して格段にフォールディング効率を向上させた。本反応は、添加剤およびpH条件等に工夫を凝らしているが、基本的にインスリンあるいはリラキシンのA鎖とB鎖をモル比1:1で混合しただけであり、従来法と比較して格段に短い反応ステップでフォールディングを達成した。インスリンやリラキシンは医薬品としての需要が高いため、本手法はこれら医薬用ペプチドホルモンの安価な市場供給に貢献できると期待できる。リラキシンのフォールディング手法に関しては2014年2月に特許を出願済みである。現在、これらの結果に関する論文をまとめている。

This study は ペ プ チ ド lock between ジ ス ル フ ィ ド bridging (SS) に よ っ て type natural イ ン ス リ の is simple and could promote behavior rate つ な acidification フ ォ ー ル デ ィ ン グ gimmick を establish す る こ と を purpose と し て い る. Pp.47-53 25 year は recorded delivery requisition に し た の "research project" に 従 い, (1) イ ン ス リ ン A lock お よ び B lock を with い た ペ プ チ ド bridging between lock SS に よ る フ ォ ー ル デ ィ ン グ の 収 rate upward を refers し た anti 応 conditions の beg, (2) イ 検 ン ス リ ン に し seaborne て optimization し た anti 応 conditions の 2 lock ペ プ チ ド ホ ル モ ン Youdaoplaceholder0 へ へ リラキシ is applicable to the main topics of を, と て, て, to set <s:1> and study the を field った. (1) の research subject application be "research project" は delivery に 従 っ て be 験 を line い type, natural イ ン ス リ ン を high rate of 収 で る for, フ ォ ー ル デ ィ ン グ anti 応 検 の conditions for line を っ た. フ ォ ー ル デ ィ ン グ 収 rate だ け で な く anti 応 process に お け る intermediates の generation に base づ い て, temperature, pH, add tonic な ど の conditions を dense に beg し 検, optimization を っ た. Results と し て, は じ め に イ ン ス リ ン A lock の intramolecular SS combination を A bridge type し, times に yuan の イ ン ス リ ン B lock を add す る こ と で SS bridge between the molecules against 応 が unseen fruit に promote さ れ, good な 収 rate で type natural の イ ン ス リ ン が must ら れ た. Youdaoplaceholder0 under conditions of low temperature and weak basicity, the で yield <s:1> increases が see られた. ま た, add tonic と し て plural の ヒ ド ロ キ シ を has an す る water-soluble add tonic を appropriate amount plus え る こ と で 収 rate を さ ら に improve す る こ と が で き た. The sequence of action of the additive である is presented in the 検 certificate である. Now, <s:1> スリ スリ <e:1> フォ フォ スリ ディ ディ ディ グ グ yield rate フォ 35-40%を achieve て て る る. 続 い て subject (2) で は, イ ン ス リ ン で optimization し た anti と 応 conditions with others の も の を リ ラ キ シ ン に も 応 with し た. Results に natural type リ ラ キ シ ン を フ ォ ー ル デ ィ ン グ 収 45 ~ 70% で must る こ と が で き, past の report comparing と し て lattice period に フ ォ ー ル デ ィ ン グ sharper rate を さ upward せ た. The anti 応 は, add tonic お よ び pH conditions に time を coagulation ら し て い る が, basic に イ ン ス リ ン あ る い は リ ラ キ シ ン の lock lock と B を モ ル ratio 1:1 で し た だ け で あ り, 従 to と compare し て lattice period of short に い anti 応 ス テ ッ プ で フ ォ ー ル デ ィ ン グ を reached し た. イ ン ス リ ン や リ ラ キ シ ン は medical 薬 product と し て の need high が い た め, this technique は こ れ ら medical 薬 with ペ プ チ ド ホ ル モ ン の Ann 価 な market supply に contribution で き る と expect で き る. リ ラ キ シ ン の フ ォ ー ル デ ィ ン グ gimmick に masato し て は に in February 2014, を out special 済 み で あ る. Now, the results of れら れら れら are に related to the する paper をまとめて る る る.

项目成果

Development of new amphiphilic cyclic selenides promoting oxidative folding reaction of disulfide-containing proteins

新型两亲性环状硒化物的开发促进含二硫键蛋白质的氧化折叠反应

• 发表时间: 2013
• 作者: Kenta Arai;and Michio Iwaoka
• 通讯作者: and Michio Iwaoka

From Sulfur to Selenium. A New Research Arena in Chemical Biology and Biological Chemistry

从硫到硒。

• 发表时间: 2012
• 期刊: Curr. Chem. Biol.
• 作者: M. Iwaoka;K. Arai
• 通讯作者: K. Arai

Heavy-Row Effects on the Nature of Weak Halogen-to-Selenium Interaction

重排效应对弱卤硒相互作用性质的影响

• 发表时间: 2012
• 作者: 荒井堅太;森合健志;岩岡道夫;Kenta Arai and Michio Iwaoka
• 通讯作者: Kenta Arai and Michio Iwaoka

SS結合含有淡白質の非酸化的フォールディング事象の酸化的フォールディング経路への取り込み

将 SS 键合白质中的非氧化折叠事件纳入氧化折叠途径

• 发表时间: 2012
• 作者: 荒井堅太;岩岡道夫
• 通讯作者: 岩岡道夫

長鎖アルキル基をもつ5員環状水溶性セレニドの合成とタンパク質の酸化的リフォールディング反応への応用

长链烷基五元环状水溶性硒化物的合成及其在蛋白质氧化重折叠反应中的应用

• 发表时间: 2013
• 作者: 荒井堅太;森合健志;岩岡道夫
• 通讯作者: 岩岡道夫