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阻害剤開発の基盤構築を目指した薬剤排出トランスポーターのＸ線結晶構造解析

药物外排转运蛋白的X射线晶体结构分析旨在为抑制剂的开发奠定基础

基本信息

批准号：
14J01576
负责人：
林克彦
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

多剤耐性菌感染症の克服に向け、菌の薬剤耐性獲得および菌の毒性発現に関与する薬剤排出トランスポーターの阻害剤開発を目指し、以下の３つの課題に取組んだ。（1.緑膿菌RND型トランスポーターMexYの構造解析 2.大腸菌多剤排出システムAcrAB-TolC複合体の結晶構造解析 3.マクロライド系抗生物質排出ABCトランスポーター MacBの結晶構造解析）平成28年度は目標に対し次の事が明らかとなった。1.MexY結晶を用いて大型放射光施設SPring 8で得たX線回折データから分子置換法で位相決定し、MexY構造を新たに決定することに成功した。しかしながら、この構造は薬剤認識・排出機能の議論をすることが難しいMexY単量体構造であった。そこで、より強固な三量体を構成するMexY変異体を作製し、このMexY変異体の薬剤耐性能および排出機能を保持することを確かめた。現在は、この変異体MexYの結晶化に取り組んでいる。2.前年度までにリンカー配列を最適化した1:1構成比のAcrB-AcrA融合たんぱく質を用いた発現量活性相関から、融合たんぱく質がそれ単体で排出活性を有することを確かめた。AcrBとTolCの間では、システイン残基を適当な場所に導入すると生理的条件で直にジスルフィド架橋を形成する。AcrB-AcrA融合蛋白質でも同様に架橋が形成されることを確かめ、親和性タグでの精製を最適化し、架橋を持ったAcrAB-TolC複合体の精製法を確立した。精製した複合体をネガティブ染色と透過型電子顕微鏡により観察すると、大きさの揃った粒子が観測された。この三者複合体の構造決定を単粒子像再構成により目指している。3.MacBの発現系を見直し、コムギ無細胞発現システムにより全長MacBを発現させた。リポソームに発現したMacBを用いて結晶化条件探索をしたが、結晶は得られていない。精製法、結晶化条件の検討を続け、構造解析可能な結晶の調製を目指す。

To overcome the infection of multi-agent resistant bacteria, to obtain the drug resistance of bacteria and to develop the drug resistance of bacteria, the following three topics were selected. (1. Structural analysis of Pseudomonas aeruginosa RND-type strain, MexY; 2. Crystal structure analysis of Escherichia coli multiple-component excretion system AcrAB-TolC complex; 3. Crystal structure analysis of antibiotic substance excretion system ABC strain, MexY) 1. The X-ray diffraction method was successfully used to determine the phase and structure of MexY. The structure of the body is difficult to understand and discharge The composition of the three components of MexY is stable, and the resistance of MexY is stable. Now, this is different from the crystallization of MexY. 2. In the past year, the composition of AcrB-AcrA fusion was optimized to 1:1, and the activity of the fusion was determined. AcrB and Toll C residues are introduced at appropriate sites under physiological conditions to form bridges. AcrB-AcrA fusion protein was purified by optimizing the affinity of the protein and establishing the purification method of the AcrAB-TolC complex. The refined complex can be dyed and observed through a transmissive electronic microscope, and large particles can be observed. The structure of the three-dimensional complex determines the reconstruction of the particle image. 3. The development of MacB is straightforward, cell-free and full-length. The crystallization conditions were explored by using the method of crystallization. Purification method, crystallization conditions, structural analysis, possible crystallization modulation, etc.