蛍光相関分光法による転写因子ＦＭＢＰ－１高速ＤＮＡ認識動態の多成分同時定量解析

使用荧光相关光谱对转录因子 FMBP-1 的高速 DNA 识别动力学进行同时多组分定量分析

• 批准号: 14J02640
• 负责人: 堤 元佐
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-04-25 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J02640/
• 关键词: 転写調節因子; 生物物理; 国際情報交換; 転写調節機構; 生物物理学

引き続き、「生細胞内で発現された転写因子の段階的なDNA認識動態について、それらの拡散動態が生じるために必要な外的・内的環境条件を決定付けること」を目的とし、研究を進めた。１．FMBP-1の超解像観察：前年度までの蛍光相関分光法（FCS）による解析から、細胞核内のFMBP-1の複数の拡散動態は、クロモソーマルDNAとの相互作用を反映すると示唆された。本年度は超解像顕微鏡によるさらなる解析を行った。蛍光標識を施したヒストン蛋白質H2BをEGFP-FMBP-1融合蛋白質と同時にHeLa細胞に発現させ、SIM顕微鏡を用いて観察した結果、野生型のFMBP-1とH2Bで明らかな共局在が見られた一方、DNA結合能欠損変異体FMBP-1とH2Bの分布が重ならないことが明示された。このことから、FMBP-1の相互作用相手が核内クロモソーマルDNAであることが確かめられた。２．FCCSによる解離定数（Kd）の導出：前年度の研究で、細胞溶解産物（ライセート）中での蛍光相互相関分光法（FCCS）測定によってFMBP-1とDNAプローブの相互作用が定量可能なことが示された。本年度はこの研究をさらに進め、多種類のFMBP-1変異体とDNAプローブを組み合わせて滴定実験を行い、Kdを算出した。野生型FMBP-1と認識配列DNAプローブ間のKdは数百nMと算出された一方、DNA結合ドメイン欠損変異体では有意な相互作用は見られず、少なくとも10 μM以上の高いKdが推定された。これらの実験の結果から、FMBP-1のDNA結合能の配列特異性が初めて定量的に示された。３．海外研究所における短期訪問研究：本年度はスウェーデン・カロリンスカ研究所に短期滞在し、同所にて開発中の多点同時FCS解析装置によるFMBP-1の拡散動態観察を試みた。現地の研究員と協力して実験系を立ち上げ、多くの測定データを得ることができた。

The purpose of this paper is to further study the development of DNA recognition dynamics in the stages of gene expression in living cells and the environmental conditions necessary for gene expression in living cells. 1. Superresolution of FMBP-1: FCS analysis of FMBP-1 in the previous year, multiple scattering dynamics of FMBP-1 in the nucleus, and reflection of DNA interactions. This year's resolution of the micro-mirror The EGFP-FMBP-1 fusion protein was detected in HeLa cells simultaneously by light labeling, and the wild-type FMBP-1 and H2B fusion protein were detected by SIM microscopy. The interaction between FMBP-1 and the nuclear DNA is very important. 2. Derivation of dissociation constant (Kd) of FCCS: The interaction between FMBP-1 and DNA can be quantified by fluorescence mutual correlation spectroscopy (FCCS) in previous years 'research. This year's research has been carried out in a variety of FMBP-1 variants, including DNA sequencing, titration and Kd calculation. Wild-type FMBP-1 has a Kd of several hundred nM between recognition and alignment DNA, and a Kd of more than 10 μM is estimated for intentional interactions with DNA binding and loss. These results indicate that the alignment specificity of DNA binding energy of FMBP-1 is preliminary and quantitative. 3. Overseas Research Institute Short-term visit research: This year, FMBP-1 dispersion dynamic observation test was conducted in the research institute for short-term lag and multi-point simultaneous FCS analysis in the development of the same institute. The researchers in the field worked together to establish a comprehensive system, and many of them were able to determine the results.

项目成果

新奇DNA結合ドメインSTPRを持つ転写因子FMBP-1のin situコンディションにおけるDNA認識動態のFCS解析

FCS 分析转录因子 FMBP-1 的原位 DNA 识别动态，FMBP-1 具有新型 DNA 结合结构域 STPR

• 发表时间: 2014
• 作者: 堤元佐;武藤秀樹;木本舞;神谷昌克;菊川峰志;滝谷重治;出村誠;河野敬一;金城政孝;相沢智康
• 通讯作者: 相沢智康

蛍光相関分光法を用いたカイコBombyx mori由来 転写因子FMBP-1の研究

荧光相关光谱研究家蚕转录因子FMBP-1

• 发表时间: 2016
• 作者: Motosuke Tsutsumi;Hideki Muto;Shohei Myoba;Mai Kimoto;Akira Kitamura;Masakatsu Kamiya;Takashi Kikukawa;Shigeharu Takiya;Makoto Demura;Keiichi Kawano;Masataka Kinjo;Tomoyasu Aizawa;堤元佐
• 通讯作者: 堤元佐

Karolinska Institute(スウェーデン)

卡罗林斯卡学院（瑞典）