蛍光相関分光法による転写因子ＦＭＢＰ－１高速ＤＮＡ認識動態の多成分同時定量解析

使用荧光相关光谱对转录因子 FMBP-1 的高速 DNA 识别动力学进行同时多组分定量分析

基本信息

批准号：
14J02640
负责人：
堤元佐
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J02640/
关键词：
転写調節因子生物物理国際情報交換転写調節機構生物物理学

项目摘要

引き続き、「生細胞内で発現された転写因子の段階的なDNA認識動態について、それらの拡散動態が生じるために必要な外的・内的環境条件を決定付けること」を目的とし、研究を進めた。１．FMBP-1の超解像観察：前年度までの蛍光相関分光法（FCS）による解析から、細胞核内のFMBP-1の複数の拡散動態は、クロモソーマルDNAとの相互作用を反映すると示唆された。本年度は超解像顕微鏡によるさらなる解析を行った。蛍光標識を施したヒストン蛋白質H2BをEGFP-FMBP-1融合蛋白質と同時にHeLa細胞に発現させ、SIM顕微鏡を用いて観察した結果、野生型のFMBP-1とH2Bで明らかな共局在が見られた一方、DNA結合能欠損変異体FMBP-1とH2Bの分布が重ならないことが明示された。このことから、FMBP-1の相互作用相手が核内クロモソーマルDNAであることが確かめられた。２．FCCSによる解離定数（Kd）の導出：前年度の研究で、細胞溶解産物（ライセート）中での蛍光相互相関分光法（FCCS）測定によってFMBP-1とDNAプローブの相互作用が定量可能なことが示された。本年度はこの研究をさらに進め、多種類のFMBP-1変異体とDNAプローブを組み合わせて滴定実験を行い、Kdを算出した。野生型FMBP-1と認識配列DNAプローブ間のKdは数百nMと算出された一方、DNA結合ドメイン欠損変異体では有意な相互作用は見られず、少なくとも10 μM以上の高いKdが推定された。これらの実験の結果から、FMBP-1のDNA結合能の配列特異性が初めて定量的に示された。３．海外研究所における短期訪問研究：本年度はスウェーデン・カロリンスカ研究所に短期滞在し、同所にて開発中の多点同時FCS解析装置によるFMBP-1の拡散動態観察を試みた。現地の研究員と協力して実験系を立ち上げ、多くの測定データを得ることができた。

该研究继续进行，目的是“确定活细胞中表达的转录因子的逐渐DNA识别动力学所必需的外部和内部环境条件，以产生这些扩散动力学”。 1。FMBP-1的超分辨率观察：荧光相关光谱（FCS）直到上一年之前通过荧光相关光谱（FC）进行分析，这表明FMBP-1在细胞核中的多种扩散动力学反映了与染色体DNA的相互作用。今年，使用超分辨率显微镜进行了进一步的分析。荧光标记的组蛋白H2B与EGFP-FMBP-1融合蛋白同时在HeLa细胞中表达，并使用SIM显微镜观察，很明显，DNA结合突变体FMBP-1和H2B的分布没有重叠。这证实了FMBP-1的相互作用伴侣是核染色体DNA。 2。通过FCC衍生解离常数（KD）：上一年的研究表明，FMBP-1和DNA探针相互作用可以通过细胞裂解物中的荧光互相关光谱（FCCS）测量来量化。今年，我们进一步提出了这项研究，并结合了各种FMBP-1突变体和DNA探针来计算KD进行滴定实验。野生型FMBP-1与识别序列DNA探针之间的KD计算为几百nm，而在DNA结合结构域缺陷型突变体中未观察到显着相互作用，并且估计了至少10μM的高KD。这些实验的结果定量证明了FMBP-1的DNA结合能力的序列特异性。 3.海外研究机构的短期访问研究：今年，我们在瑞典的Karolinska研究所呆了很短的时间，并试图使用当前在同一设施中开发的多点FCS分析设备来观察FMBP-1的扩散动态。我们能够与当地研究人员合作启动实验系统，并且能够获得大量的测量数据。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

新奇DNA結合ドメインSTPRを持つ転写因子FMBP-1のin situコンディションにおけるDNA認識動態のFCS解析

FCS 分析转录因子 FMBP-1 的原位 DNA 识别动态，FMBP-1 具有新型 DNA 结合结构域 STPR

DOI：
发表时间：
2014
期刊：
影响因子：
0
作者：
堤元佐;武藤秀樹;木本舞;神谷昌克;菊川峰志;滝谷重治;出村誠;河野敬一;金城政孝;相沢智康
通讯作者：
相沢智康

Karolinska Institute(スウェーデン)

卡罗林斯卡学院（瑞典）

DOI：
发表时间：
期刊：
影响因子：
0
作者：
通讯作者：

蛍光相関分光法を用いたカイコBombyx mori由来転写因子FMBP-1の研究

荧光相关光谱研究家蚕转录因子FMBP-1

DOI：
发表时间：
2016
期刊：
影响因子：
0
作者：
Motosuke Tsutsumi;Hideki Muto;Shohei Myoba;Mai Kimoto;Akira Kitamura;Masakatsu Kamiya;Takashi Kikukawa;Shigeharu Takiya;Makoto Demura;Keiichi Kawano;Masataka Kinjo;Tomoyasu Aizawa;堤元佐
通讯作者：
堤元佐