Establishment of a novel deep 3D super-resolution observation method for living organisms by spatiotemporal fluorescence correlation analysis

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本研究課題は、既存の光学的アプローチによる超解像顕微鏡法では観察困難な、生体脳深部や腫瘍塊内部で生じる微細な生命現象の可視化を目指し、蛍光強度の空間・時間相関解析に基づく深部３次元超解像観察法の構築を目的とする。2022年度は当初計画通り、画像処理による超解像顕微鏡法SRRF（Super-Resolution Radial Fluctuations）の３次元拡張（3D-SRRF）に向けて、蛍光３次元イメージング法の洗練化と高速画像処理のための環境構築を進めた。ニポウディスク式多点走査型２光子顕微鏡とピエゾ駆動Zステージを組み合わせ、マウス由来オルガノイドを対象に高速３次元イメージングの検討実験を行った。同観察では、数種類の高NA対物レンズによる観察を比較し、SRRF解析に十分なピクセルサイズを実現し、組織深部観察が可能な長作動距離型100倍シリコン浸対物レンズが本法の観察に適していることが確認された。同対物レンズを用いることで、数秒で細胞塊全体を3次元で画像取得可能だった。また、本研究に関連して２光子超解像観察に適した蛍光色素開発を共同研究で進め、今年度に成果論文が出版された。SRRFの３次元拡張の取り組みに関して、本年度にSRRF法の原著者らがプレプリントとして発表した発展型SRRF（eSRRF、多焦平面顕微鏡像に対する3D-SRRF機能も含まれる）について、マウス固定脳スライスサンプルでのeSRRF観察を試した。その結果、微細形態の再現性が従来のSRRF法よりも改善していることが確認できた。一方で、我々が求める定量性を維持した超解像化の面では、従来のSRRF法の方が線形な処理を用いており優れていた。さらに、3D-SRRF処理の高速化に必要な画像解析環境構築のため、SRRF処理に適した高速空間処理計算が可能な高性能GPUを搭載した解析PCを選定・カスタマイズし、導入した。