Establishment of a novel deep 3D super-resolution observation method for living organisms by spatiotemporal fluorescence correlation analysis

利用时空荧光相关分析建立生物体深度3D超分辨观测新方法

• 批准号: 22K14578
• 负责人: 堤 元佐
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K14578/
• 关键词: 蛍光顕微鏡; 超解像顕微鏡; 深部イメージング; ３次元超解像; イメージング; 深部観察; in vivo

本研究課題は、既存の光学的アプローチによる超解像顕微鏡法では観察困難な、生体脳深部や腫瘍塊内部で生じる微細な生命現象の可視化を目指し、蛍光強度の空間・時間相関解析に基づく深部３次元超解像観察法の構築を目的とする。2022年度は当初計画通り、画像処理による超解像顕微鏡法SRRF（Super-Resolution Radial Fluctuations）の３次元拡張（3D-SRRF）に向けて、蛍光３次元イメージング法の洗練化と高速画像処理のための環境構築を進めた。ニポウディスク式多点走査型２光子顕微鏡とピエゾ駆動Zステージを組み合わせ、マウス由来オルガノイドを対象に高速３次元イメージングの検討実験を行った。同観察では、数種類の高NA対物レンズによる観察を比較し、SRRF解析に十分なピクセルサイズを実現し、組織深部観察が可能な長作動距離型100倍シリコン浸対物レンズが本法の観察に適していることが確認された。同対物レンズを用いることで、数秒で細胞塊全体を3次元で画像取得可能だった。また、本研究に関連して２光子超解像観察に適した蛍光色素開発を共同研究で進め、今年度に成果論文が出版された。SRRFの３次元拡張の取り組みに関して、本年度にSRRF法の原著者らがプレプリントとして発表した発展型SRRF（eSRRF、多焦平面顕微鏡像に対する3D-SRRF機能も含まれる）について、マウス固定脳スライスサンプルでのeSRRF観察を試した。その結果、微細形態の再現性が従来のSRRF法よりも改善していることが確認できた。一方で、我々が求める定量性を維持した超解像化の面では、従来のSRRF法の方が線形な処理を用いており優れていた。さらに、3D-SRRF処理の高速化に必要な画像解析環境構築のため、SRRF処理に適した高速空間処理計算が可能な高性能GPUを搭載した解析PCを選定・カスタマイズし、導入した。

该研究主题旨在可视化大脑内部和肿瘤质量内发生的精细生物学现象，这些现象很难使用现有的光学方法观察，并构建了基于荧光强度的空间和时间相关分析的深层三维超分辨率观察方法。在最初计划的2022财年中，我们继续对3D荧光3D成像方法进行改进，并为高速图像处理创造环境，旨在使用图像处理扩展3D超分辨率径向荧光显微镜（SRRF）。将NIPPO磁盘型多点扫描两光子显微镜和压电驱动的Z阶段合并，以研究小鼠衍生的类器官上的高速三维成像。通过比较几种类型的高NA物镜透镜来进行观察结果，并确认长期工作距离100倍硅沉浸物镜晶状体可实现足够的像素大小进行SRRF分析并允许进行深层组织观察，适合使用此方法观察。通过使用相同的物镜镜头，可以在短短几秒钟内以三个维度获取整个细胞质量。此外，与这项研究有关，对适合观察两光子超级分辨率的荧光染料的发展进行了联合研究，并于今年发表了一份论文。关于在三维SRRF中扩展SRRF的努力，我们测试了Advanced SRRF的小鼠固定脑切片样品的ESRRF观察结果（ESRRF（ESRRF）（ESRRF，它还包括用于多尾平面显微镜图像的3D-SRRF函数），该功能今年由SRRF方法的原始作者发表为预印本。结果，已经证实，优质形态的可重复性已经改善了常规SRRF方法。另一方面，就保持我们寻求的定量性质的超分辨率而言，常规的SRRF方法是优越的，因为它使用线性处理。此外，为了创建更快的3D-SRRF处理所需的图像分析环境，已经选择，自定义和介绍了适用于适用于SRRF处理的高速空间处理计算的高性能GPU的分析PC。

项目成果

Absorption, fluorescence, and two-photon excitation ability of 5-phenyl-13-arylisoindolo[2,1-a]quinolines prepared by one-pot reaction of ring-closing metathesis and 1,3-dipolar cycloaddition

闭环复分解和1,3-偶极环加成一锅反应制备5-苯基-13-芳基异吲哚并[2,1-a]喹啉的吸收、荧光和双光子激发能力

• DOI: 10.1016/j.dyepig.2023.111118
• 发表时间: 2023
• 期刊: Dyes and Pigments
• 影响因子: 4.5
• 作者: Ramon Avena Francisco;Wada Yuki;Ishii Hirokazu;Watakabe Yuki;Tsutsumi Motosuke;Jang Kwangkyun;Otomo Kohei;Qiao Lin;Fujii Yuki;Tsujino Hirofumi;Tsutsumi Yasuo;Nemoto Tomomi;Arisawa Mitsuhiro
• 通讯作者: Arisawa Mitsuhiro

In vivo super-resolution two-photon microscopy based on spatiotemporal correlation analysis

基于时空相关分析的活体超分辨双光子显微镜

• 发表时间: 2022
• 作者: Ramon Avena Francisco;Wada Yuki;Ishii Hirokazu;Watakabe Yuki;Tsutsumi Motosuke;Jang Kwangkyun;Otomo Kohei;Qiao Lin;Fujii Yuki;Tsujino Hirofumi;Tsutsumi Yasuo;Nemoto Tomomi;Arisawa Mitsuhiro;Tsutsumi Motosuke
• 通讯作者: Tsutsumi Motosuke