ＭＡＰキナーゼ活性の可視化による植物免疫機構の解明

植物独自の免疫システムは、2段階の質的に異なる抵抗反応で構成されるが、共通してMAPKカスケードを介して発揮される。1つのシグナル伝達経路が異なる応答を誘導する要因として、MAPK活性の持続時間の長さや強度の違いが考えられる。病原菌認識後のMAPKの活性動態を調べるには、従来の生化学的解析とは異なり、非破壊的にMAPK活性を評価できる実験系が必要である。本研究では、MAPKの活性動態を可視化するバイオセンサー (MAPKセンサー) を作製し、病原菌が感染した細胞でMAPK活性を時間的・空間的に観察することで、MAPKシグナル伝達機構の分子基盤を構築することを目的とした。本センサーは、MAPKによる基質タンパク質のリン酸化に応答し、2種の隣接した蛍光タンパク質間で蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) が起こるように設計している。FRET強度には、2種の蛍光タンパク質間の距離と角度が重要であり、リン酸化活性に依存して生体内で理想的な配置をとる構造を模索する必要がある。蛍光タンパク質の配向やリンカーの種類を検討し、FRET強度比 (ON/OFF) が1.3以上となる実用レベルのセンサーの作製に成功した。また、MAPKセンサーに細胞内局在シグナルを付加し、任意に植物細胞内での局在を調整した。それらセンサーを一過的に発現させたベンサミアナタバコ葉に免疫応答を誘導すると、それぞれの細胞内局在部位においてFRETによる蛍光が観察された。この結果から、作製したMAPKセンサーが、MAPK活性のライブイメージングを可能にする有用なツールであることが示された。

植物独自の免疫システムは、2段階の質的に異なる抵抗反応で構成されるが、共通してMAPKカスケードを介して発揮される。1つのシグナル伝達経路が異なる応答を誘導する要因として、MAPK活性の持続時間の長さや強度の違いが考えられる。病原菌認識後のMAPKの活性動態を調べるには、従来の生化学的解析とは異なり、非破壊的にMAPK活性を評価できる実験系が必要である。本研究では、MAPKの活性動態を可視化するバイオセンサー (MAPKセンサー) を作製し、病原菌が感染した細胞でMAPK活性を時間的・空間的に観察することで、MAPKシグナル伝達機構の分子基盤を構築することを目的とした。本センサーは、MAPKによる基質タンパク質のリン酸化に応答し、2種の隣接した蛍光タンパク質間で蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) が起こるように設計している。FRET強度には、2種の蛍光タンパク質間の距離と角度が重要であり、リン酸化活性に依存して生体内で理想的な配置をとる構造を模索する必要がある。蛍光タンパク質の配向やリンカーの種類を検討し、FRET強度比 (ON/OFF) が1.3以上となる実用レベルのセンサーの作製に成功した。また、MAPKセンサーに細胞内局在シグナルを付加し、任意に植物細胞内での局在を調整した。それらセンサーを一過的に発現させたベンサミアナタバコ葉に免疫応答を誘導すると、それぞれの細胞内局在部位においてFRETによる蛍光が観察された。この結果から、作製したMAPKセンサーが、MAPK活性のライブイメージングを可能にする有用なツールであることが示された。