Transfektion von Eimeria nieschulzi Sporozoiten mit Reportergen und Selektionsmarkern und anschließende Kultivierung in vitro

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Plasmid-Konstrukte mit Sequenzen von Eimeria tenella (Etactin5`, Etmic5`) einem spezifischen Parasiten des Haushuhns, sollen in Bakterien hergestellt und anschließend in Sporozoiten von Eimeria nieschulzi, einem Parasiten der Ratte transfiziert werden. Zur gezielten Selektion transfizierter Sporozoiten ist weiterhin eine Sequenz des DHFR-Gens einkloniert, das Resistenz gegen Pyrimethamin verleiht. Die transfizierten Sporozoiten sollen anschließend in Zellkultur zur Entwicklung gebracht werden und mit Hilfe der Fluoreszenzmarker GFP bzw. YFP die zunächst transienten Transformanten nachgewiesen werden. Erstes Teilziel ist, die Expression von Mikronemenprotein und Actin in lebenden Sporozoiten und Meronten der 1. und 2. Generation zu verfolgen. In einem zweiten Schritt sollen dann stabil transfizierte Sporozoiten, die Gene für ein Mikronemen und/oder Actin-Protein sowie ein weiteres Apicoplastenprotein (acyl carrier protein, acp) enthalten, hergestellt werden. Die Gensequenzen sollen gleichfalls mit den Reportergenen für GFP/YFP gekoppelt, ins Genom der Parasiten integriert werden. In Zellkulturen lassen sich transfizierte Merozoiten bis zu 2. Meronten-Generation heranzüchten, die dann allerdings über einen Tierversuch auf den natürlichen Wirt, die Ratte, übertragen werden müssen. Über die Reporterproteine läßt sich die Expression der verschiedenen Gene während der Entwicklungsstadien (Merogonie in Zellkultur und Gamogonie im Wirtstier Ratte) nachweisen und mikroskopisch dokumentieren. Als langfristiges Ziel ist nach erfolgreichem Abschluß der Teilziele die Herstellung von knock-out Mutanten für ein weiteres Gen, das für Hüllbildungskörper in Gamonten kodiert, vorgesehen.