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新規Ｒｉｅｓｋｅ型酸素添加酵素の探索と機能解析

新型Rieske型加氧酶的搜索和功能分析

基本信息

批准号：
15F15089
负责人：
野尻秀昭
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2017-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15F15089/
关键词：
oxygenase evolution thermophile

项目摘要

平成27年度末までに、高熱性細菌のゲノム情報から、Rieske型芳香環ジオキシゲナーゼ（RO）の末端水酸化酵素コンポーネント大サブユニット遺伝子（合計44種）を見いだし、その中で特に重要と考えられたThermus oshimai JL-2株とGeobacillus thermoglucosidasius NBRC107763株由来の二種について小サブユニット遺伝子と共に発現用ベクターにクローン化して、大腸菌での発現系を構築していた。また、JL-2株ゲノムからは2種のフェレドキシン遺伝子と4種のフェレドキシン還元酵素遺伝子の候補を、NBRC107763株ゲノムからは1種のフェレドキシン遺伝子と3種のフェレドキシン還元酵素遺伝子の候補を発見し、クローン化を開始していた。平成28年度は、これに引き続き、クローン化を終了させ、大腸菌細胞内においてROの各コンポーネント候補を種々の組み合わせで発現させる系を構築した。現在までにSDS-PAGE解析にて明瞭なタンパク質の発現は検出できていないが、微量でも活性が検出できる場合も多いため、本プロジェクトの遂行者であるChakrabortyらにより構築されたデータベースを用いて、まず基質の推定を行った。その結果、多環芳香族炭化水素、ヘテロ環式芳香族化合物、安息香酸誘導体などが基質として推定され、活性検出に使用する基質候補を絞り込むことができた。現在、これらの推定基質に対する酸素添加活性を評価するとともに、両株ゲノム中の当該遺伝子の破壊を試みている。なお、本年度の重要な成果の一つとして、ゲノム解析とROコンポーネント候補の抽出・機能推定に関しては、アメリカ微生物学会と極限微生物の国際学会で発表するとともに、既にAMB Express誌で発表した。

At the end of 2007, there were 44 species of terminal hydroacidifying enzymes in the Rieske type aromatic ring (RO), including Thermus oshimai JL-2 strain and Geobacillus thermosidasius NBRC107763 strain. E. coli growth system is constructed. The JL-2 strain has two kinds of protein genes, four kinds of protein genes and three kinds of protein genes. The NBRC107763 strain has two kinds of protein genes and three kinds of protein genes and three kinds of protein genes. In 2008, the construction of a new system for the production of recombinant proteins in Escherichia coli cells was carried out. SDS-PAGE analysis showed that the protein was detected in the presence of trace amounts of enzyme activity in the presence of DNA, and that the enzyme activity in the presence of DNA was detected in the presence of DNA. Results: Polycyclic aromatic hydrocarbons, cyclic aromatic compounds, benzoic acid inducers, substrates for estimation, substrates for use in activity assays Now, the acid-adding activity of these putative substrates will be evaluated, and the disruption of this gene in the plant genome will be tested. This year's important achievements include: analysis, extraction, functional estimation, presentation by the Society for Microbiology and the International Society for Extreme Microbiology, and presentation by AMB Express.