定量リン酸化プロテオミクスによる大規模リン酸化ストイキオメトリー解析

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本研究は、ホスト研究室が得意とする翻訳後修飾・定量プロテオミクス技術をベースとし、候補者が得意とする新規手法開発と細胞生物学への応用を行うものである。具体的には、細胞内で生じている数万種のタンパク質リン酸化修飾それぞれに対し、基底状態でのリン酸化ストイキオメトリー（部位ごとのリン酸化されている割合）がどのくらいで、どのような刺激が加わると、ストイキオメトリーがどのくらいの時間でどのくらい変動するのかを測定し、システム生物学的観点から、細胞機能とストイキオメトリー絶対値もしくは変動値がどのような関係にあるのかを一網打尽に解明しようとする研究である。前年度に引き続き細胞内リン酸化修飾ストイキオメトリー測定法の確立を検討した。脱リン酸化ステップなしで、10-plexアイソバリックタグ化を用いた酵素的リン酸化反応を行い、阻害薬であらかじめ処理した細胞を含む10種類の試料について、内在性のリン酸化修飾とin vitroリン酸化修飾を個別に定量することで、内在性リン酸化修飾のストイキオメトリーを測定する方法の確立を検討した。また、この方法を複数のキナーゼに対して同時に行うことにより、阻害薬標的キナーゼの下流も含めたパスウェイ変動解析に適用できないかを検討した。EGFR阻害薬であるafatinib処理したHeLa細胞についてERK2およびSRCをもちいて解析したところ、EGFRパスウェイについて幅広くその変動をとらえることに成功した。特に、従来法で困難であったチロシンリン酸化サイトについて1218サイトの変動を定量することに成功した。さらに、チロシンリン酸化サイトの基底状態のストイキオメトリーはERK2標的であるセリンリン酸化サイトよりも優位に低いことがわかった。