ウイルスＲＮＡセンサータンパク質によるウイルス感染認識分子機構の解明

阐明病毒RNA传感器蛋白识别病毒感染的分子机制

• 批准号: 15J04718
• 负责人: 吉田 藍子
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J04718/
• 关键词: 細胞膜の形態; エンドサイトーシス; クラスリン依存的エンドサイトーシス; 皮層アクチン; 原子間力顕微鏡; 高速原子間力顕微鏡

本年度は、生細胞におけるウイルスRNAへの応答機構を解明する基盤となる技術の開発をすべく、細胞研究用として試作された共焦点顕微鏡一体型高速原子間力顕微鏡を細胞表層で起こる現象の観察に応用し、分子の局在と微細な構造を同時に可視化する観察系の確立に成功した。高速原子間力顕微鏡による生細胞観察から、細胞表面には①60～110 nm、②150～300 nmの直径の異なる2種類の膜のくぼみ（ピット）があり、ピットの開閉が起きていることが明らかになった。ピットのサイズから、カベオリン依存的、クラスリン依存的エンドサイトーシスのピットであることが示唆されたため、各経路のマーカータンパク質とピットの共局在を検証した。結果、大きなピットはクラスリン依存的、小さなピットはカベオリン依存的エンドサイトーシスのピットであることが分かり、クラスリンの経路では“膜の隆起がピットにフタする”ことが明らかとなった。AFMによる膜直下の皮層アクチンの観察によって、膜の隆起形成にはアクチンが関与していることが示唆された。そこで、アクチン関連因子（アクチン、Arp2/3複合体など）をターゲットとした阻害剤による機能阻害と、RNA干渉法によるタンパク質の発現量の低下を行った。これらの条件で、膜の隆起の形成が顕著に抑えられ、閉じたピットが再び開く“不可逆的に開閉するピット”が増加した。この結果は、クラスリン被覆ピットを細胞膜から切り離すステップでは、Arp2/3 複合体等のアクチン関連タンパク質が一過的に集積し、細胞膜を上に押し上げると共に、小胞を下に押し下げることで、不可逆的な膜の切り離しが行われていることを示唆するものである。ここで確立された生細胞での分子の局在と微細な構造を同時に可視化する観察系は、今後、生細胞内でのウイルス感染により誘発される感染認識の素過程を理解する上で、重要な基盤となる。

This year は, cell に お け る ウ イ ル ス RNA へ の 応 answer institutions を interpret す る base plate と な る technology の open 発 を す べ く, cell research と し て attempt さ れ た total focus 顕 micro mirror a high-speed interatomic force size 顕 micromirror を cell surface で こ る phenomenon の 観 examine に 応 し, molecular の bureau in the と subtle な を structure at the same time に visualization す る 観 examine is の indeed Establish に success た. High-speed atomic force between 顕 micromirror に よ る living cells 観 examine か ら, cell surface に は (60 ~ 110 nm, (2) 150 ~ 300 nm の の different diameter な る 2 kinds の membrane の く ぼ み (ピ ッ ト) が あ り, ピ ッ ト の open closed が up き て い る こ と が Ming ら か に な っ た. ピ ッ ト の サ イ ズ か ら, カ ベ オ リ ン interdependent, ク ラ ス リ ン dependent エ ン ド サ イ ト ー シ ス の ピ ッ ト で あ る こ と が in stopping さ れ た た め, each 経 の マ ー カ ー タ ン パ ク qualitative と ピ ッ ト の total bureau in を 検 card し た. Results, large き な ピ ッ ト は ク ラ ス リ ン dependent, small さ な ピ ッ ト は カ ベ オ リ ン dependent エ ン ド サ イ ト ー シ ス の ピ ッ ト で あ る こ と が points か り, ク ラ ス リ ン の 経 road で は "membrane の uplift が ピ ッ ト に フ タ す る" こ と が Ming ら か と な っ た. AFM に よ る membrane by の cortex ア ク チ ン の 観 examine に よ っ て, membrane の uplift formed に は ア ク チ ン が masato and し て い る こ と が in stopping さ れ た. そ こ で, ア ク チ ン masato even factor (ア ク チ ン, Arp2/3 complex な ど) を タ ー ゲ ッ ト と し た resistance against tonic に よ る function resistance against と, RNA dry involved method に よ る タ ン パ ク qualitative の 発 line is low quantity の を っ た. で こ れ ら の conditions, membrane の の bulge forming が 顕 the に え suppression ら れ and closing じ た ピ ッ ト が drive く び again "irreversible に open closed す る ピ ッ ト" が raised plus し た. The results of <s:1> すステップで and ラスリ are that the ピットを cell membrane is covered with ピットを and ら is cut off from すステップで すステップで and Arp2/3 Complex such as の ア ク チ ン masato even タ ン パ ク qualitative after が に set product し, cell membrane を に detain し げ る と に, vesicular down を に し under げ る こ と で cut and irreversible な membrane の り from し が line わ れ て い る こ と を in stopping す る も の で あ る. こ こ で establish さ れ た living cells で の molecular の innings while と subtle な tectonic を に visualization す る は 観 was made in the department, in the future, living cells で の ウ イ ル ス infection に よ り 発 lure さ れ る infection knowledge の element process を す る で, important な base plate と な る.

项目成果

Nano-scale live cell imaging of cell cortex by fast-scanning atomic force microscope

通过快速扫描原子力显微镜对细胞皮层进行纳米级活细胞成像

• 发表时间: 2016
• 作者: Yoshida A;Sakai N;Uekusa Y;Zhang Y;Kumeta M;Ito S;Yoshimura SH.
• 通讯作者: Yoshimura SH.

Probing in vivo dynamics of membrane/cortical actin networks using high-speed atomic force/fluorescence microscopy

使用高速原子力/荧光显微镜探测膜/皮质肌动蛋白网络的体内动力学

• 发表时间: 2015
• 作者: Yoshida Aiko;Sakai Nobuaki;Uekusa Yoshitsugu;Kumeta Masahiro;Ito Shuichi;Yoshimura Shige H.
• 通讯作者: Yoshimura Shige H.

Involvement of actin dynamics in endocytotic process revealed by fast-scanning atomic force microscope

快速扫描原子力显微镜揭示肌动蛋白动力学参与内吞过程

• 发表时间: 2017
• 作者: YOSHIDA A;SAKAI N;UEKUSA Y;ZHAN Y;KUMETA M;YOSHIMURA SH
• 通讯作者: YOSHIMURA SH

高速原子間力顕微鏡による生体膜動態のライブセルイメージング

使用高速原子力显微镜对生物膜动力学进行活细胞成像

• 发表时间: 2016
• 作者: 吉田藍子;酒井信明;植草良嗣;粂田昌宏;吉村成弘
• 通讯作者: 吉村成弘

Morphological analysis of clathrin-mediated endocytotic process by fast-scanning atomic force microscope

快速扫描原子力显微镜对网格蛋白介导的内吞过程的形态学分析

• 发表时间: 2017
• 作者: YOSHIDA A;ZHAN Y;ITAGAKI Y;KUMETA M;SUZUKI Y;SAKAI N;UEKUSA Y;YOSHIMURA SH
• 通讯作者: YOSHIMURA SH