遊離代謝物を用いた１３Ｃ代謝フラックス解析法の構築と動物細胞代謝プロセスへの応用

利用游离代谢物构建13C代谢流分析方法及其在动物细胞代谢过程中的应用

• 批准号: 15J05988
• 负责人: 岡橋 伸幸
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J05988/
• 关键词: 13C代謝フラックス解析; がん細胞; 中心炭素代謝; p53変異; 絶対定量; 質量分析; 動物培養細胞; 代謝工学; 還元的グルタミン代謝

近年、疾患細胞に特異的な代謝が報告されており、細胞内代謝の計測ニーズが高まっている。代謝を直接的に理解するためには、代謝フラックス（反応速度）を計測する13C代謝フラックス解析法が有効である。昨年度の研究では、遊離代謝物の13C標識割合を計測することで培養がん細胞に適用可能な代謝フラックス解析法を構築し、既知の代謝阻害剤を用いて解析法の妥当性を検証することができた。そこで本年度は、構築した手法を用いてがん抑制遺伝子p53の変異が中枢代謝経路に与える影響のフラックスレベルでの解明に取り組んだ。まず、p53欠損マウス軟部腫瘍由来細胞株（コントロール株）にレトロウィルスベクターを用いて変異型p53を再構成した（p53mut株）。両株の比増殖速度に有意な差はみられなかった。一方、細胞内代謝物の絶対定量を行ったところ、p53mut株では細胞内ピルビン酸やクエン酸の蓄積量がコントロール株に比べて61%、52%に減少していた。このことから、変異型p53が中枢代謝経路のフラックスに影響を与えていることが示唆された。そこで、コントロール株とp53mut株を [1-13C]グルコースを含む培地で24時間培養し、13C代謝フラックス解析を行った。ガスクロマトグラフ質量分析装置で細胞内遊離代謝物の13C標識割合を計測し、フラックス分布を推定することができた。ペントースリン酸経路のフラックスには変化がなかったのに対し、p53mut株では、解糖系のフラックスがコントロール株の80％程度に減少していた。また、グルタミンの取り込みやTCAサイクル、リンゴ酸酵素のフラックスも70～80％程度に減少していた。以上の結果より、変異型p53は中枢代謝経路のうち解糖系とTCAサイクルのフラックスを負に制御していることが明らかとなった。

In recent years, the special reports of patients with diseases and diseases have been reported on behalf of the patients, and the intracellular generations have been calculated to increase the incidence of disease. In this paper, we directly understand that there are some problems in the analytical method of the 13C generation. In the last year's research and research, the 13C standard was cut off in order to use the possible analytical method, and the known analytical method to prevent the damage. In this year's program, we used the method to suppress the expression of p53 gene in the central nervous system, and to determine the accuracy of the system. The origin of the cell strain (p53mut strain) was higher than that of p53 (cell strain). The reproductive speed of the plant is intentionally lower than that of the plant. On the one hand, the amount of intracellular substance was measured by quantitative analysis, and that of p53mut strain was less than that of 61% and 52%, respectively. The central nervous system of type-I p53 and type-I p53 have a negative effect on the central nervous system. The culture of p53mut strain [1-13C] contains 24-hour incubation and 13C generation culture analysis. In the quantitative analysis device, the 13C tag is cut off and the distribution is presumed. This is the best way to cure the disease. I don't know what to do. I don't know how to treat you. The levels of acid enzymes and acid enzymes are 70%, 80%, 80%, 80%, 70%, 80%, 80%, 70%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80%, 80% The results of the above results show that the expression of p53 gene in the central nervous system (TCA) is very sensitive to the development of glucose.

项目成果

p53欠損マウス軟部腫瘍由来細胞株の13C代謝フラックス解析

p53 缺陷型小鼠软组织肿瘤来源细胞系的 13C 代谢通量分析

• 发表时间: 2015
• 作者: 岡橋伸幸;河野晋;松田史生;高橋智聡;清水浩
• 通讯作者: 清水浩

同位体非定常情報を用いた動物培養細胞の13C代謝フラックス解析

使用同位素非平稳信息对培养动物细胞进行 13C 代谢通量分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 岡橋 伸幸;前田 昂亮;河野 晋;松田 史生;高橋 智聡;清水 浩
• 通讯作者: 清水 浩

動物培養細胞中枢代謝経路の13C代謝フラックス解析法の構築

培养动物细胞中心代谢途径13C代谢流分析方法的构建

• 发表时间: 2015
• 作者: 岡橋伸幸;松田史生;河野晋;高橋智聡;清水浩
• 通讯作者: 清水浩

13C代謝フラックス解析法を用いた動物培養細胞のNADPHターンオーバー速度の計測

利用 13C 代谢通量分析法测定培养动物细胞中 NADPH 周转率

• 发表时间: 2016
• 作者: 岡橋 伸幸;松田 史生;河野 晋;高橋 智聡;清水 浩
• 通讯作者: 清水 浩

同位体ターンオーバー情報を用いた中心代謝フラックス解析法の構築

利用同位素周转信息构建中心代谢流分析方法

• 发表时间: 2016
• 作者: 岡橋伸幸;前田昴亮;荒木千絵;河野晋;松田史生;高橋智聡;清水浩
• 通讯作者: 清水浩