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Development of a detection system for epigenetic modifications using enzyme fused zinc finger protein

使用酶融合锌指蛋白开发表观遗传修饰检测系统

基本信息

批准号：
15J08615
负责人：
李鎭煕
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2015
资助国家：
日本
起止时间：
2015-04-24 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究ではDNAのメチル化を始めとするエピジェネティック修飾を、がんをはじめとする種々の疾患の早期・術中診断の指標として利用することを想定し、アルカリフォスファターゼ融合ジンクフィンガー蛋白質（ALP融合ZFP）の開発、及びそれを用いた検出システムの開発を目的とし、研究を行った。平成29年度は、ALP融合ZFPを用いた種々の標的DNA検出システムの構築を行った。まず、ALP融合ZFPによって標的のDNAを検出できるかをプレートアッセイによって確かめた。標的DNAのモデルである大腸菌O157のゲノムDNAを検出したところ、標的DNAの濃度に依存してシグナルが上昇し、10コピーの感度から検出することができた。一方で、標的ではないサルモネラ菌のゲノムDNAを検出した際にはシグナルの上昇が観察されなかったことから特異性にも優れた検出法であることが示された。また、小型で高感度な標的DNAの検出系を構築するため、チップ電極を用いた標的DNAの電気化学的な検出システムの開発も行った。ここではプレートではなくアビジンビーズ上に標的DNAを固定しALP融合ZFPによる検出を行った。ビーズと基質であるp-aminophenyl phosphateを混合し、酵素反応によって生じる反応生成物をチップ電極上で検出することで、電気化学的に標的DNAの検出を行った。結果として、グルコース脱水素酵素を用いた場合よりも100倍程度高感度に標的DNAを検出することができた。以上本年度は、ALPを融合したZFPを用いて化学発光、または電気化学的なシグナルに基づく標的DNAの検出システムの構築を行った。昨年度Biosensors and Bioelectronics誌に報告したDNAのメチル化検出法と、本検出法を組み合わせることで、より高感度なDNAメチル化の検出が期待できる。

This study is based on the DNA modification and modification of DNA. Indicators for early stage and intraoperative diagnosis of various diseases and the utilization of scenarios , アルカリフォスファターゼ fusion ALPHA protein (ALP fusion ZFP ) の开発, and びそれを用いた検出システムの开発をpurpose とし, research を行った. In 2009, the ALP fusion ZFP was constructed using the DNA of the original target.まず, ALP fusion ZFP によって standard DNA を検出できるかをプレートアッセイによって真かめた. Target DNAのモデルであるEliform coli O157のゲノムDNAを検出したところ、Target DN A's concentration dependence is rising, and 10's sensitivity is rising. One side, the target is the DNA of the bacteria, the target is the root of the virus Rising が観看されなかったことからSpecificity にも优れた検出法であることが Showされた.また, small and high-sensitivity DNA の検Out system construction するため, チップelectrode を using いたtarget DNA のelectrochemical な検出システムの开発も行った.ここではプレートではなくアビジンビーズにlabeled DNA をfixed しALP fused to ZFP による検出行った.ビーズとstroma p-aminophenyl Phosphate is mixed, enzyme reaction is reacted with the reaction product, the product is reacted with the electrode, and DNA is used as the target of electrochemical chemistry. As a result, the DNA of the high-sensitivity target 100 times higher than the として and the グルコース dehydrase enzyme was used in the いた case. This year, the above-mentioned ALP fused ZFP was constructed using the DNA of the なシグナルにbased base of the いて Chemical Co., Ltd. and the またdensho Chemical's なシグナルにbased base. Last year's Biosensors and Bioelectronics reports that the DNA will be chemically modified, the original DNA will be modified and the group will be combined, and the high-sensitivity DNA will be chemically modified and will be expected to be released.