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Development of gene therapy for hypophosphatasia

低磷酸酯酶基因治疗的进展

基本信息

批准号：
20K08268
负责人：
三宅弘一
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-01 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

低フォスファターゼ症は組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNALP）遺伝子の異常によって発症する常染色体劣勢の先天性代謝異常症で、特に重症度の高い周産期型は全身の骨形成不全を伴って生後早期に死亡する。我々は低フォスファターゼ症の周産期型モデルマウスを使用し、TNALP発現アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターによる新規治療法（遺伝子治療）の研究を進めてきており、モデルマウスの延命効果や正常な骨形成などの良好な治療結果を得ている。本研究では今までの研究結果を基に、安全性の高いTNALP発現AAVベクターの１回の筋肉注射による新規治療法の実用化に向けて、本治療法の有効性と安全性を大型動物である霊長類を用いて検討を行う。本年度はTNALPを発現する組換えAAVベクターの作製を行い、霊長類（アカゲザル）への投与を行った。AAVベクター作成に関して、TNALPは筋肉内より分泌し骨親和性を持つようにSolubleのTNALPにD10を修飾したもの(TNALP-D10)を使用し、AAVベクターの血清型は筋肉細胞で発現効率が高い８型を使用した。作製したAAVベクタープラスミドとAAVのcap, rep発現パッケージングプラスミド及びヘルパープラスミドをHEK293細胞にPEI法にて遺伝子導入し、その細胞内及び上清よりAAVベクターを回収し、Iodexanolを用いた超遠心とカラムにより精製濃縮を行った。作製後AAVベクターの力価の測定を行い、in vitroでの発現の確認を行った。作成されたAAVベクターをHeLa細胞、C2C12細胞に遺伝子導入し、上清のALP活性を測定したところ十分な活性が認められた。このウイルスベクターをアカゲザルの外側広筋に投与（1x10*13 vg/ml)を行った。現在までに投与アカゲザルの血清中のALPの上昇を認めており、今後経過を追って観察してく。

Hypoplasia is an autosomal deficient congenital metabolic disorder that develops due to abnormalities in tissue-nonspecific Alien Leukemia Protein (TNALP) genes. The particularly severe high-middle-perinatal form is associated with systemic bone formation insufficiency and death in the early postnatal period. We have made progress in the study of new therapeutic methods (genetic therapy) for the treatment of low birth rate, low birth rate, low birth rate and abnormal bone formation. This study is based on the results of the present study, and TNALP has found that the safety of AAV is very high. The application of new treatment methods for muscle injection is very important. The effectiveness and safety of this treatment method are discussed in large animals. This year, TNALP has been launched, and AAV has been launched. AAV serogroup was created with high serogroup 8 detection rate of TNALP, DNALP, D10 and DNALP-D10 modified by Soluble. In HEK293 cells, PEI method was used for gene introduction into HEK293 cells, intracellular and supernatant AAV purification, and Iodexanol purification and concentration. The determination of the force of the AAV after production, and the confirmation of the occurrence of the AAV in vitro AAV cells and C2C12 cells were constructed to detect ALP activity in supernatant. This is the first time I have ever seen such a thing. The increase of ALP in serum is recognized now and observed later.