放線菌の生産するプレニルインドールアルカロイドの生合成研究

放线菌异戊二烯吲哚生物碱的生物合成研究

• 批准号: 15J10131
• 负责人: 小林 正弥
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-24 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15J10131/
• 关键词: アルカロイド; 生合成; 放線菌; テルペノイド; プレニル基転移酵素

本年度は放線菌の生産するプレニルインドール化合物カルキノスタチンAの生合成マシナリーの解明に取り組み、そのカルバゾール骨格形成の分子機構の解明を目指した。標識前駆体を用いたトレーサー実験の結果から、カルバゾールの炭素骨格はトリプトファン、ピルビン酸、2分子の酢酸に由来することが示唆されていた。この結果を考慮し、カルバゾール生合成の初期段階ではトリプトファンおよびピルビン酸の縮合、およびアシル側鎖の付加が生じ、次いでこれらの炭素鎖を骨格として閉環反応が進み、カルバゾール環構造が形成されると予想した。そこで、炭素－炭素結合形成および環化反応に関与すると推定したケトアシルACP合成酵素CqsB1、機能未知タンパク質CqsB2、チアミン依存型酵素CqsB3に着目し、これらの組換え酵素を用いてin vitro解析を実施した。その結果、CqsB1, 2, 3の全酵素を含む反応系においてのみ、カルバゾール骨格を有する生合成中間体を確認することができた。この結果から、カルバゾール骨格の生合成における一連の増炭、閉環、酸化反応の全てをCqsB1, 2, 3が担うことが明らかとなった。特に、CqsB2は閉環反応およびオルトキノン形成を触媒するカルバゾール環合成酵素であることが判明した。カルバゾール環形成の鍵酵素であるCqsB2の反応機構を解明するため、さらに本酵素のX線結晶構造解析を実施した。SeMet置換体結晶を用いたSAD法により構造決定を行った結果、CqsB2の初期構造が明らかとなった。今後、立体構造に基づく機能解析を進めることで、前例のないカルバゾール環形成の触媒機構を解明できると考えている。本研究により、自然界におけるアルカロイドの生合成機構の多様性の一端を示すことができたと同時に、新たな生物活性物質の創出に向けた生合成経路あるいは酵素の改良・設計への貢献が期待される。

This year, the production of radioactive bacteria, chemical compounds, synthesis, elucidation, and molecular mechanism for the formation of molecular frameworks were directed. The results of the preparation of the precursor were as follows: 1. The origin of the carbon skeleton, 2. The molecular structure of the precursor was as follows: The results are considered in the initial stages of the synthesis of carbon chain, such as condensation of carbon acid, condensation of carbon chain, formation of carbon chain, and formation of carbon chain structure. Therefore, the putative role of the catallic ACP synthase CqsB1, the functionally unknown protein CqsB2, and the catalin-dependent enzyme CqsB3 in carbon-carbon bond formation and cyclization reactions are of interest. These enzymes were used in vitro analysis. The results showed that CqsB1, 2, 3 and CqsB1, 2, 3 were the most important enzymes in the synthesis of CqsB1, 2, 3 and CqsB2. As a result of this, the synthesis of carbon, closed loop and acidification reactions in the synthesis of carbon, closed loop and acidification reactions in CqsB1, 2, 3 are carried out. In particular, CqsB2 was identified as a closed-loop enzyme. The X-ray crystal structure analysis of the enzyme has been carried out. SeMet substitution crystal is determined by SAD method, and the initial structure of CqsB2 is determined by SAD method. From now on, the basic function analysis of three-dimensional structure shall be further studied, and the catalytic mechanism of ring formation shall be clarified. This study is aimed at demonstrating the diversity of biosynthetic mechanisms in nature and at improving the design of biosynthetic mechanisms for novel bioactive substances.

项目成果

プレニルインドール化合物carquinostatin Aの生合成研究

异戊二烯吲哚类化合物卡喹诺他汀A的生物合成研究

• 发表时间: 2018
• 作者: 小林正弥;新家一男;西山真;葛山智久
• 通讯作者: 葛山智久

アリル基質同士の縮合と環化反応を触媒する 新奇テルペン合成酵素の発見

发现一种新型萜烯合酶，可催化烯丙基底物之间的缩合和环化反应

• 发表时间: 2015
• 作者: 小林正弥;尾﨑太郎;趙平,富田武郎;苅田祐馬;保野陽子;西村栄治;品田哲郎;西山真;葛山智久
• 通讯作者: 葛山智久

シクロラバンデュリル2リン酸合成酵素の結晶構造解析

环拉班杜利二磷酸合酶的晶体结构分析

• 发表时间: 2016
• 作者: 小林正弥;富田武郎;品田哲郎;西山真;葛山智久
• 通讯作者: 葛山智久

Biosynthesis of Prenylated Indole Alkaloids in Bacteria

细菌中异戊二烯化吲哚生物碱的生物合成

• 发表时间: 2016
• 作者: Kobayashi M.;Nishiyama M.;Kuzuyama T.
• 通讯作者: Kuzuyama T.

Biosynthesis of Prenylated Indole Alkaloids in Streptomyces

链霉菌中异戊二烯化吲哚生物碱的生物合成

• 发表时间: 2017
• 作者: Masaya Kobayashi;Makoto Nishiyama;Tomohisa Kuzuyama
• 通讯作者: Tomohisa Kuzuyama