In situ detection of genes in bacterial cells using flourescent dye-labeled polynucleotide probes (RING-FISH): Improvements of specificity and permeabilization as well as its application for environmental studies
使用荧光染料标记的多核苷酸探针(RING-FISH)原位检测细菌细胞中的基因:特异性和通透性的改进及其在环境研究中的应用
基本信息
- 批准号:5440409
- 负责人:
- 金额:--
- 依托单位:
- 依托单位国家:德国
- 项目类别:Research Grants
- 财政年份:2004
- 资助国家:德国
- 起止时间:2003-12-31 至 2007-12-31
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
Recently, we could for the first time successfully visualize bacterial genes at cellular level by RING-FISH (Recognition of Individual Genes by Fluorescent In Situ Hybridization). The method is based upon a modified in situ cell hybridization procedure using gene specific polynucleotide transcript probes. The presence of the respective genes is indicated by probe conferred cell fluorescence. The typically halo-like cell fluorescence is usually visualized by laser scanning microscopy. Whereas conventional FISH applying rRNA-targeted oligonucleotide probes benefits from natural target amplification, the detection of single or oligocopy genes essentially depends upon intensive signal amplification. As shown recently, the latter is conferred by inter-molecular probe network formation. Although the general applicability of this new, powerful and attractive technique has been shown, further essential improvements are necessary before the method can be used for environmental studies. Given that the approach has been applied for a small selection of genes and few gram-negative species thus far, it has to be adapted for a broader spectrum of genes (especially nifH) and bacteria (especially gram-positives). Concerning probe specificity limitations result from the need for polynucleotide probes. Synthetic constructs comprising multiple units of gene specific oligonucleotides have to be developed to ensure higher specificity. In this context, major efforts are needed to solve the problem of network formation by synthetic probe constructs. Moreover, the permeabilization of gram-positive bacteria has to be improved for a better access of polynucleotide probes. Environmental studies will be performed concerning the assignment of nifH genes classified by RING-FISH to microbial cells identified by conventional rRNA FISH.
最近,我们首次通过RING-FISH(通过荧光原位杂交识别单个基因)在细胞水平上成功地可视化了细菌基因。该方法基于使用基因特异性多核苷酸转录物探针的改良原位细胞杂交程序。通过探针赋予的细胞荧光指示各个基因的存在。典型的晕状细胞荧光通常通过激光扫描显微镜可视化。而传统的FISH应用rRNA靶向的寡核苷酸探针受益于天然靶扩增,检测单个或寡拷贝基因基本上取决于密集的信号放大。如最近所示,后者是由分子间探针网络的形成。虽然这种新的,强大的和有吸引力的技术的普遍适用性已被证明,进一步的必要改进之前,该方法可以用于环境研究。鉴于该方法迄今为止已应用于少量选择的基因和少数革兰氏阴性菌种,因此必须将其适用于更广泛的基因(尤其是nifH)和细菌(尤其是革兰氏阳性菌)。关于探针特异性,由于需要多核苷酸探针而导致限制。必须开发包含多个基因特异性寡核苷酸单元的合成构建体以确保更高的特异性。在这种情况下,需要作出重大努力来解决通过合成探针构建体形成网络的问题。此外,革兰氏阳性菌的透化必须得到改善,以更好地获得多核苷酸探针。将进行环境研究,将通过RING-FISH分类的nifH基因分配给通过常规rRNA FISH鉴定的微生物细胞。
项目成果
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