新たなエイズウイルス免疫標的、リポペプチドの研究－マウスからサル、そしてヒトへ－

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29年度前期の研究結果から、個体レベルにおける効率的なリポペプチド免疫応答の誘導を行うためには、抗原提示経路を分子レベルで理解することが重要であると考えられた。そこで、平成29年度後期、ヒトの遺伝子を標的としたゲノムワイドのCRISPRノックアウトライブラリーをaddgeneより入手した。１つの細胞上でペプチド抗原提示とリポペプチド抗原提示を同時に比較するために、代表的なヒトのペプチド提示分子であるHLA-B27を選び、LP1 -IRES- HLA-B27のコンストラクトを構築し、浮遊細胞株K562へと導入した。今年度は、このK562細胞株に対してCRISPRノックアウトライブラリーを作用させ、LP1の細胞表面での発現制御に関わる分子群を網羅的に同定することを目的とした研究を行った。K562/LP1-IRES-B27高発現クローンに対し、CRISPRノックアウトライブラリー（Cas9遺伝子、gRNAライブラリーおよびPuromycin耐性遺伝子を含むレンチウイルスベクター）を導入し、ノックアウト処理を施した。導入24時間後からPuromycinによる薬剤選択を開始し、14日間の培養を行った。培養後の細胞をLP1、HLA-B27特異的な抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーによって解析した結果、HLA-B27の発現には殆ど変化は無いが、LP1の発現が上昇している細胞集団が、レンチウイルスベクター感染依存的に観察された。一方で、LP1の発現のみが低下した細胞集団を明確に観察することはできなかった。そこで、LP1の発現のみが上昇している細胞集団をソーティングし、ゲノムDNAの回収を行った。回収したゲノムに対してgRNA領域をPCRにより特異的に増幅し、クローニングベクターへとクローニングし、配列解析を実施した。その結果、オートファジーの機能に関わる複数の遺伝子が同定された。