高浸透圧ストレスで形成される新規細胞内構造体ＡＳＫ３グラニュールの解析

当研究室でストレス応答性MAPキナーゼ経路を構成する分子として同定されたASK3は低浸透圧や定常状態では細胞質に拡散して存在しているが、高浸透圧ストレスに応じて数分でグラニュール(ASK3グラニュール)を形成することが観察された。本研究ではASK3グラニュール構成因子を解析することで、ASK3を介する細胞の浸透圧ストレス応答におけるグラニュールの役割を解明することを目的とした。まずASK3グラニュールと既知の細胞内構造体との共局在性の検討を共焦点レーザー顕微鏡により行ったが、ASK3グラニュールと局在が一致するものは見出せなかった。また、電子顕微鏡観察によってもASK3グラニュールと共局在する細胞内小器官などは観察されなかった。次に、高浸透圧1時間におけるASK3グラニュールを単離・精製し、質量分析計で構成タンパク質の同定を行なったところ、HSP70と、HSP70の機能を補助するタンパク質として知られるBAG2が高いスコアで同定された。HSP70のシャペロン活性がASK3に与える影響を調べるため、HSP70阻害剤を処置した状態でイムノブロットを行なったところ、高浸透圧で阻害剤を処置すると不溶化するASK3が増えることが確認された。また、阻害剤処置時のASK3の局在を観察したところ、30分の高浸透圧刺激によりASK3グラニュールの浸透圧依存的な可逆性が失われることが確認された。HSP70が高浸透圧によるASK3の活性変化に影響を与えるか調べるため、阻害剤処置下でのASK3のリン酸化の程度を検討したところ、通常は高浸透圧でASK3が速やかに脱リン酸化されるのに対し、阻害剤処置によってASK3の脱リン酸化が抑制された。この結果から、HSP70が高浸透圧でASK3を正常な構造に保ち、ASK3の脱リン酸化を可能にする役割を持つことが示唆された。

当研究室でストレス応答性MAPキナーゼ経路を構成する分子として同定されたASK3は低浸透圧や定常状態では細胞質に拡散して存在しているが、高浸透圧ストレスに応じて数分でグラニュール(ASK3グラニュール)を形成することが観察された。本研究ではASK3グラニュール構成因子を解析することで、ASK3を介する細胞の浸透圧ストレス応答におけるグラニュールの役割を解明することを目的とした。まずASK3グラニュールと既知の細胞内構造体との共局在性の検討を共焦点レーザー顕微鏡により行ったが、ASK3グラニュールと局在が一致するものは見出せなかった。また、電子顕微鏡観察によってもASK3グラニュールと共局在する細胞内小器官などは観察されなかった。次に、高浸透圧1時間におけるASK3グラニュールを単離・精製し、質量分析計で構成タンパク質の同定を行なったところ、HSP70と、HSP70の機能を補助するタンパク質として知られるBAG2が高いスコアで同定された。HSP70のシャペロン活性がASK3に与える影響を調べるため、HSP70阻害剤を処置した状態でイムノブロットを行なったところ、高浸透圧で阻害剤を処置すると不溶化するASK3が増えることが確認された。また、阻害剤処置時のASK3の局在を観察したところ、30分の高浸透圧刺激によりASK3グラニュールの浸透圧依存的な可逆性が失われることが確認された。HSP70が高浸透圧によるASK3の活性変化に影響を与えるか調べるため、阻害剤処置下でのASK3のリン酸化の程度を検討したところ、通常は高浸透圧でASK3が速やかに脱リン酸化されるのに対し、阻害剤処置によってASK3の脱リン酸化が抑制された。この結果から、HSP70が高浸透圧でASK3を正常な構造に保ち、ASK3の脱リン酸化を可能にする役割を持つことが示唆された。