Proteomanalysen zur Identifikation und Charakterisierung von vakuolenspezifischen Transportproteinen

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Annähernd 20-30 % aller Gene eines tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Genoms kodieren für integrale Membranproteine, die sowohl für den Stoffaustausch zwischen den Zellen als auch innerhalb verschiedener Zellorganellen verantwortlich sind. In Arabidopsis thaliana ist die Funktion von ca. 2/3 aller nach Vollendung des Arabidopsisgenomprojekts vorhergesagten Membranproteine noch unbekannt. Informationen über das Expressionsmuster und die subzelluläre Lokalisation dieser Proteine kann dazu beitragen, die Funktion im pflanzlichen Organismus in planta aufzuklären. Im Vergleich der verschiedenen Organellen sind bis jetzt nur wenige vakuoläre Membranproteine näher untersucht. Um Informationen über Membranproteine der Vakuole zu erhalten, werden wir Tonoplasten aus Arabidopsis thaliana und Brassica oleracea isolieren, mit dem Ziel, vakuoläre Transportproteine mit Hilfe von chromatographischen und massenspektrometrischen Analysen zu identifizieren. Die postulierte Lokalisation der Proteine in der Vakuolenmembran soll in einem zweiten Schritt durch die Herstellung von GFP-Fusionsstrukturen verifiziert werden. Anschließend wird eine detaillierte funktionelle Charakterisierung interessanter putativer Transporter über die Analyse von knock-out Mutanten, Antisense- bzw. RNAi-Pflanzen und Überexpressionspflanzen erfolgen. Zusätzliche elektrophysiologische Untersuchungen an isolierten Vakuolen oder Tonoplastvesikeln und die Charakterisierung der vakuolären Proteine in der Hefe als heterologes Expressionssystem vervollständigen die funktionelle Charakterisierung der Proteine.