ダイオキシン受容体（ＡＨＲ）のリガンド認識及び転写活性化機構の構造科学的解明

二恶英受体（AHR）配体识别和转录激活机制的结构科学阐明

• 批准号: 17J10586
• 负责人: 櫻井 駿也
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J10586/
• 关键词: 構造生物学; X線結晶構造解析; 電子顕微鏡解析; 動物細胞を用いた発現確認; 熱安定性向上変異体; 結晶構造解析

本研究ではダイオキシン受容体(Aryl hydrocarbon receptor, AHR)についてリガンドの詳細な認識機構及び一連の転写制御機構の解明を目指し、構造生物学的な研究を行った。具体的には転写活性化複合体であるAHR/ARNT/リガンド/DNA複合体、転写抑制複合体であるAHRR/ARNTについてX線結晶構造解析または電子顕微鏡を用いた単粒子解析による構造決定を目指した。前年度までにAHR/ARNTについて熱安定性を向上させた変異体を作製し、結晶化スクリーニングを行った。また、AHRR/ARNTについては結晶構造解析に成功し、AHRRによるAHRの転写抑制機構の構造基盤を明らかにした(Sakurai et al., J Biol Chem., 2017)。本年度はAHR/ARNTについて、フラグメント抗体であるFv-claspとの複合体での結晶化を目指した。Fv-claspは従来のフラグメント抗体に比べて構造の柔軟性が少なく、結晶性が良いという特徴を持つ。抗体にはPAペプチド(GVAMPGAEDDVV)を認識するNZ-1を用いた。PAペプチドはそれ自身がβターン構造を形成するという特徴を持つことから、AHR、ARNTのβターンまたはループ領域にPAペプチドを挿入した。PAペプチドを挿入したAHR/ARNTについて発現量及びNZ-1結合能が良好なペプチド挿入位置をAHR、ARNTそれぞれ2か所、5か所見出した。それらの挿入位置を組み合わせて1～6か所PAペプチドを挿入したAHR/ARNTの高純度サンプルを調製した。得られたサンプルについてNZ-1 Fv-claspとの結合を確認し、NZ-1との複合体を調製した。得られたサンプルを用いて結晶化スクリーニングを行ったが、結晶を得ることはできなかった。また、AHR/ARNT/リガンド/DNAについて、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析を行い、12オングストロームと低分解能ではあるが三次元密度マップを得ることに成功した。得られたマップはHIF/ARNTなどのbHLH-PASファミリーの結晶構造から予測されるモデルと同様の形状をしていた。

This study で は ダ イ オ キ シ ン by let body (Aryl hydrocarbon receptor, AHR) に つ い て リ ガ ン ド の detailed な institutions and び for の planning system of writing imperial institutions の interpret を refers な し, structural biology research line を っ た. Specific に は planning write activation complex で あ る AHR ARNT / リ ガ ン ド / DNA complex, planning to write inhibit complex で あ る AHRR/ARNT に つ い て X-ray crystal structure parsing ま た は electronic 顕 micromirror を with い た 単 particle analytical に よ る structure decision を refers し た. Before the annual ま で に AHR/ARNT に つ い て thermal stability を upward さ せ た - variant を as し, crystallization ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た. ま た, AHRR/ARNT に つ い て は crystal structure analytical に し success, AHRR に よ る AHR の planning write inhibit institutions の structure substrate を Ming ら か に し た (Sakurai et al., j. Biol Chem., 2017). This year's は AHR/ARNT に つ い て, フ ラ グ メ ン ト antibody で あ る Fv - clasp と の complex で の crystallization を refers し た. Fv - clasp は 従 to の フ ラ グ メ ン ト antibody に than べ て tectonic の softness が less な く, crystalline が good い と い う, 徴 を つ. Antibodies に に PAペプチド(GVAMPGAEDDVV)を recognize するNZ-1を use に た. PA ペ プ チ ド は そ れ itself が beta タ ー を ン structure formation す る と い う, 徴 を hold つ こ と か ら, AHR, ARNT の beta タ ー ン ま た は ル ー プ field に PA ペ プ チ ド を scions into し た. PA ペ プ チ ド を scions into し た AHR/ARNT に つ い て 発 now and び NZ - 1 binding energy が good な ペ プ チ ド scions into position を AHR, ARNT そ れ ぞ れ か 2, 5 か see out し た. そ れ ら の scions into position を group み close わ せ て 1 ~ 6 か PA ペ プ チ ド を scions into し た AHR/ARNT の high-purity サ ン プ ル を modulation し た. Have ら れ た サ ン プ ル に つ い て Fv NZ - 1 - clasp と の を confirm し, NZ - 1 と の complex を modulation し た. Have to ら れ た サ ン プ ル を with い て crystallization ス ク リ ー ニ ン グ を line っ た が, crystallization を る こ と は で き な か っ た. ま た, AHR/ARNT / リ ガ ン ド / DNA に つ い て, ク ラ イ オ electronic 顕 micromirror に よ る 単 particle analytical line を い, 12 オ ン グ ス ト ロ ー ム と low decomposition can で は あ る が three dimensional density マ ッ プ を have る こ と に successful し た. Have ら れ た マ ッ プ は HIF/ARNT な ど の bHLH - PAS フ ァ ミ リ ー の crystal structure か ら be さ れ る モ デ ル と with others の shape を し て い た.

项目成果

Aryl hydrocarbon receptorの機能発現機構解明に向けた構造生物学的研究

旨在阐明芳基烃受体功能表达机制的结构生物学研究

• 发表时间: 2017
• 作者: 櫻井駿也;大戸梅治;清水敏之
• 通讯作者: 清水敏之

AhRR-ARNTヘテロダイマーによるAhRの転写抑制機構の構造基盤

AhRR-ARNT 异二聚体的 AhR 转录抑制机制的结构基础

• 发表时间: 2018
• 作者: 櫻井駿也;清水敏之;大戸梅治
• 通讯作者: 大戸梅治

The crystal structure of AhRR/ARNT complex

AhRR/ARNT复合物的晶体结构

• 发表时间: 2017
• 作者: Sakurai Shunya;Shimizu Toshiyuki;Ohto Umeharu
• 通讯作者: Ohto Umeharu

Aryl hydrocarbon receptor repressor (AhRR)によるAhRの転写抑制機構の構造基盤解明

阐明芳烃受体阻遏物 (AhRR) 的 AhR 转录抑制机制的结构基础

• 发表时间: 2017
• 作者: 櫻井駿也;大戸梅治;清水敏之
• 通讯作者: 清水敏之

転写抑制複合体AhRR/ARNTの結晶構造解析

转录抑制复合物 AhRR/ARNT 的晶体结构分析

• 发表时间: 2018
• 作者: 櫻井駿也;清水敏之;大戸梅治
• 通讯作者: 大戸梅治