Entwicklung und Anwendung ESR-spektroskopischer Methoden zur Analyse von Struktur und Dynamik integraler Membranproteine am Modell des Na+/Prolin-Transporters PutP

ESR 光谱方法的开发和应用，利用 Na/脯氨酸转运蛋白 PutP 模型分析整合膜蛋白的结构和动力学

• 批准号: 5452538
• 负责人: Professor Dr. Gunnar Jeschke
• 金额: --
• 依托单位: Laboratorium für Physikalische Chemie (LPC)
• 依托单位国家: 德国
• 项目类别: Research Grants
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 德国
• 起止时间: 2004-12-31 至 2009-12-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://gepris.dfg.de/gepris/projekt/5452538?language=en
• 关键词: Entwicklung; und; Anwendung; ESR; spektroskopischer

Das beantragte Projekt verfolgt zwei Ziele: Zum einen sollen ESR-spektroskopische Methoden zur Analyse von Struktur und struktureller Dynamik von integralen Membranproteinen weiterentwickelt werden. Zum anderen sollen am Modell des Na+/Prolin- Transporters PutP Informationen zu den strukturellen Grundlagen des Na+/Substrat-Symports und zu ligandinduzierten Konformationsänderungen des Transporters gewonnen werden. Dabei sollen Analysen der Dynamik, der Zugänglichkeit und der Umgebungspolarität der Nitroxidlabel einfach markierter Transportermoleküle Informationen zur Proteintopographie liefern. Als neue Techniken sollen hier Vierpuls-DEER-Messungen zur Bestimmung des Ausschlussvolumens (laterale Lokalisierung der Markierungsstelle) und 31P-ENDOR-Messungen zur Ermittlung des Abstandes des Spinmarkers zur Lipidkopfgruppe (Lokalisierung in der Membrannormalen) eingesetzt werden. Weiterhin soll durch die Analyse von Dipol-Dipol-Wechselwirkungen doppelt spinmarkierter Transportermoleküle ein Netzwerk intramolekularer Abstände im Bereich zwischen 0,5 und 8 nm ermittelt und dessen Beeinflussung durch die Bindung von Liganden untersucht werden. Diese methodische Stoßrichtung beinhaltet die Entwicklung eines iterativen Zusammenspiels von Proteinchemie, cwESR, Puls-ESR und Modellierung. Dabei soll durch Templatgenerierung aus Abstands- und Positionsrestriktionen und nachfolgender kontinuierlicher Verfeinerung letztlich ein Strukturmodell für eine aus fünf bis sieben Transmembrandomänen bestehende Kernregion des Transporters erstellt werden, aus dem gleichzeitig eine quantitative Abschätzung ligandinduzierter Konformationsänderungen hervorgeht. Ein solches Modell würde erstmalig einen komplexen Einblick in Struktur und funktionell relevante Dynamik eines Na+/Substrat- Symporters geben.

本研究的目的是探讨一种适用于韦尔登蛋白质整体结构和结构动力学分析的电喷雾共振波谱分析方法。在Na +/脯氨酸转运蛋白PutP信息的基础上建立Na+/底物转运蛋白的结构和韦尔登转运蛋白的配体信息。通过对氮氧自由基标记物的动力学、Zugänglichkeit和Umgebungspolarität的分析，可以标记转运分子的信息，从而使蛋白质拓扑图更清晰。新的技术是用Vierplan-DEER-Messungen测定Ausschlussvolumens（lateralelokalisierung der Markierungsstelle）和31 P-ENDOR-Messungen测定Spinmarkers（Lokalisierung in der Membrannormalen）对脂质组的抑制。通过对偶极-偶极-负离子选择性的分析，我们发现，在0.5和8 nm波长范围内，通过与配体的结合，可以使自旋标记转运体分子在分子内吸收，并产生明显的影响，这是韦尔登。该方法包括蛋白质化学、电子自旋共振（ESR）、脉冲电子自旋共振（Puls-ESR）和模型化的迭代开发。Dabei soll durch Templatgenerierung aus Abstands- und Positionsrestriktionen und nachfolgender kontinuierlicher Verfeinerung letztlich ein Strukturmodell für eine aus fünf bis sieben Transmembrandomänen bestehende Kernregion des Transporters erstelt韦尔登，aus dem gleichzeitig eine quantitative Abschätzung ligandinduzierter Konformationsänderungen hervorgeht. Ein solches Modell würde erstmalig einen komplexen Einblick in Struktur und funktionell relevante Dynamik eines Na+/Substrat- Symporters geben.