Entwicklung und Anwendung ESR-spektroskopischer Methoden zur Analyse von Struktur und Dynamik integraler Membranproteine am Modell des Na+/Prolin-Transporters PutP

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Das beantragte Projekt verfolgt zwei Ziele: Zum einen sollen ESR-spektroskopische Methoden zur Analyse von Struktur und struktureller Dynamik von integralen Membranproteinen weiterentwickelt werden. Zum anderen sollen am Modell des Na+/Prolin- Transporters PutP Informationen zu den strukturellen Grundlagen des Na+/Substrat-Symports und zu ligandinduzierten Konformationsänderungen des Transporters gewonnen werden. Dabei sollen Analysen der Dynamik, der Zugänglichkeit und der Umgebungspolarität der Nitroxidlabel einfach markierter Transportermoleküle Informationen zur Proteintopographie liefern. Als neue Techniken sollen hier Vierpuls-DEER-Messungen zur Bestimmung des Ausschlussvolumens (laterale Lokalisierung der Markierungsstelle) und 31P-ENDOR-Messungen zur Ermittlung des Abstandes des Spinmarkers zur Lipidkopfgruppe (Lokalisierung in der Membrannormalen) eingesetzt werden. Weiterhin soll durch die Analyse von Dipol-Dipol-Wechselwirkungen doppelt spinmarkierter Transportermoleküle ein Netzwerk intramolekularer Abstände im Bereich zwischen 0,5 und 8 nm ermittelt und dessen Beeinflussung durch die Bindung von Liganden untersucht werden. Diese methodische Stoßrichtung beinhaltet die Entwicklung eines iterativen Zusammenspiels von Proteinchemie, cwESR, Puls-ESR und Modellierung. Dabei soll durch Templatgenerierung aus Abstands- und Positionsrestriktionen und nachfolgender kontinuierlicher Verfeinerung letztlich ein Strukturmodell für eine aus fünf bis sieben Transmembrandomänen bestehende Kernregion des Transporters erstellt werden, aus dem gleichzeitig eine quantitative Abschätzung ligandinduzierter Konformationsänderungen hervorgeht. Ein solches Modell würde erstmalig einen komplexen Einblick in Struktur und funktionell relevante Dynamik eines Na+/Substrat- Symporters geben.