Optimierung von RNAi-Methode zur Durchführung funktioneller Genomik in Erdbeerfrüchten

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Im Vorantrag konnte gezeigt werden, dass das Einschleusen von doppelsträngiger RNA, die korrespondierend zu spezifischen endogenen Gensequenzen ist, zur Inhibierung der entsprechenden Genfunktion in Erdbeerfrüchten führt. Hierbei wurden Konstrukte mittels Agrobakterien in unreife Früchte eingebracht, die umgekehrt angeordnete Kopien eines Transgens mit einem Intron als Spacer hinter einem starken Promotor (intron hairpin RNA Konstrukt, ihpRNA) transkribieren. Diese spezielle Technik der RNA-Interferenz eignet sich zur Funktionsanalyse von reifekorrelierten Genen wie dies beispielhaft an einem Chalkonsynthase (FaCHS)-, Anthocyanidinsynthase (FaANS)- und Glucosyltransferase (FaGT1)-Gen demonstriert wurde. Auch die Integration der Pflanzengensequenz in das virale Genom eines RNA-Virus und die Infektion der Pflanzen mit diesem rekombinanten Virus (virus-induced gene silencing, VIGS) verliefen erfolgreich. In Weiterführung dieser Arbeiten ist das Ziel des vorliegenden Projektes die Effizienz der Methoden zu optimieren um diese für Hochdurchsatz-Verfahren nutzen zu können. So soll durch Verwendung verschiedener definierter Sequenzabschnitte der FaCHS und des OMethyltransferasegens (FaOMT) diejenigen Teilstücke identifiziert werden, die für eine erfolgreiche Herabregulation der pflanzeneigenen Gene als doppelsträngige RNA vorliegen müssen. Weiterhin ist geplant die hierbei erzielten Ergebnisse für die Ausschaltung verschiedener Gene des Flavonoidstoffwechsels (FaANR, FaLAR, FaDFR) und mit bisher unbekannten Funktionen (FaGT3, FaGT4) anzuwenden. Es sollen jeweils die Auswirkungen der Herabregulation auf die mRNA-, Protein- und Metabolitengehalte untersucht werden. Parallel dazu wird das VIGS-System weiter entwickelt da hiermit auch die Funktion derjenigen Gene untersucht werden kann, die in der frühen Reifungsphase exprimiert werden. Die Untersuchungen führen auch zu Erkenntnissen der Replikation und Ausbreitung des SMYEV in Erdbeeren in zeitlicher Hinsicht nach Infektion sowie zur Akkumulation in verschiedenen Pflanzenorganen. Gleichzeitig wird die Eignung des bislang einzigen Virus-Vektorsystems in Erdbeeren untersucht.