新規ターゲット因子に着目した化学物質の神経毒性評価系構築と生体リスク評価

聚焦新目标因子的化学物质神经毒性评价体系构建及生物风险评估

基本信息

批准号：
18J01790
负责人：
石田慶士
金额：
$ 2.33万
依托单位：
Gifu Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2021-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J01790/
关键词：
核呼吸因子ー１毒性評価系核呼吸因子-1 NRF-1 UBE2D1

项目摘要

令和2年度は構築したNRF-1活性評価系を用いて十数種類の化合物について小規模スクリーニングを試みた。レポータープラスミドを導入したNeuro2A細胞に様々な濃度の各化合物を曝露し、死細胞染色色素であるPropidium Iodideの蛍光強度とEGFPの蛍光強度を測定することで、細胞生存率とNRF-1活性の用量反応曲線を作成した。その結果、①細胞死が起きるよりも低い濃度でNRF-1活性が低下した化合物群、②検討した濃度では細胞死は起きなかったがNRF-1活性は低下した化合物群、③細胞死と同時にNRF-1活性が低下した化合物群の３つの群に被験物質を分類することができた。③の群は細胞死が原因でEGFPの蛍光が低下したと考えられるが、①と②の群は細胞死が起きる前段階でNRF-1活性が特異的に低下したと考えられる。以上の結果より、一部の化学物質がNRF-1活性阻害作用のポテンシャルを有することが明らかとなった。本研究課題は令和2年度で終了するが、引き続き化合物数を増やしてNRF-1活性評価の大規模スクリーニングを行い、NRF-1活性を阻害する化学物質を探索する予定である。さらに令和2年度はNRF-1の新規下流遺伝子として既に同定しているUBE2D1遺伝子のプロモーター解析を引き続き進め、UBE2D1プロモーター上のNRF-1結合配列の同定を試みた。UBE2D1プロモーターの一部領域を組み込んだ複数のレポータープラスミドを作製しレポーターアッセイを行ったところ、既知のNRF-1結合配列と類似したGCリッチな14bpのDNA配列においてNRF-1に対する応答性が認められた。以上より、UBE2D1発現はNRF-1により直接的に制御されており、NRF-1はUBE2D1発現調節を介してタンパク質分解系に関与している可能性が明らかとなった。

在2020年，我们尝试使用构建的NRF-1活动评估系统对十几种化合物进行小规模筛选。通过将每种化合物的各种浓度暴露于用报告基因质粒引入的神经2A细胞，并测量死细胞染色丙旋二抗丙二酰碘化物的荧光强度和EGFP的荧光强度，从而产生了细胞活力和NRF-1活性的剂量反应曲线。结果，可以将测试物质分为三组：1）一组NRF-1活性在低于细胞死亡的浓度下降低的化合物，2）一组化合物在研究浓度下降低了NRF-1活性的化合物，而3）NRF-1活性在同一NRF-1的活性在细胞死亡时减少。据认为，组③降低了由于细胞死亡而导致的EGFP荧光，但是组①和②特别降低了细胞死亡前的NRF-1活性。以上结果表明，某些化学物质具有抑制NRF-1活性的潜力。该研究主题将在2020年结束，但我们计划继续增加化合物的数量，并进行大规模筛查以进行NRF-1活动评估，并寻找抑制NRF-1活性的化学物质。此外，在2020年，已经被确定为NRF-1的新型下游基因的UBE2D1基因的启动子分析被继续，并试图鉴定UBE2D1启动子上的NRF-1结合序列。制备了融合UBE2D1启动子部分区域的多个报告基因质粒，并在富含GC的14 bp DNA序列中显示出对NRF-1的反应性，类似于已知的NRF-1结合序列。从上面可以揭示出UBE2D1表达受NRF-1的直接调节，并且NRF-1可以通过调节UBE2D1表达来参与蛋白水解系统。

项目成果

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专著数量（0）

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专利数量（0）

In vivo profiling of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced estrogenic/anti-estrogenic effects in female estrogen-responsive reporter transgenic mice.

DOI：
10.1016/j.jhazmat.2019.121526
发表时间：
2019-10
期刊：
Journal of hazardous materials
影响因子：
13.6
作者：
Ichiro Yoshida;K. Ishida;Hiroshi Yoshikawa;S. Kitamura;Youhei Hiromori;Yasushi Nishioka;A. Ido
通讯作者：
Ichiro Yoshida;K. Ishida;Hiroshi Yoshikawa;S. Kitamura;Youhei Hiromori;Yasushi Nishioka;A. Ido

核呼吸因子-1 (NRF-1)によるユビキチン結合酵素D1 (UBE2D1)の発現制御

核呼吸因子 1 (NRF-1) 对泛素结合酶 D1 (UBE2D1) 表达的调节