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新奇メバロン酸経路関連酵素を用いた次世代バイオ燃料の微生物生産システムの開発

使用新型甲羟戊酸途径相关酶开发下一代生物燃料微生物生产系统

基本信息

批准号：
18J12896
负责人：
本山賢人
金额：
$ 0.96万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18J12896/
关键词：
イソプレノイドメバロン酸経路酵素アーキア

项目摘要

ガソリンの代替燃料として有望視される化合物イソペンテノール(IOH)の微生物生産に取り組む研究がこれまで複数例報告されており、異種生物由来のメバロン酸(MVA)経路を大腸菌へ導入する生合成システムが利用された。しかし、同経路では多段階に渡る酵素反応とATP消費を必要とし、改良の余地が残されている。MVAからIOHへの変換反応を一段階で触媒する人工酵素MVAデカルボキシラーゼ(MVD)が作製できれば、既存のIOH生産システムの改良が期待できる。本研究では、MVD作製に必要となる機能的要素の一部を有する2種類の酵素、MVA 3-キナーゼ(M3K)およびジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼに着目した。両酵素のX線結晶構造の比較、および部位特異的な変異導入実験の結果、MVD作製の手がかりとなる知見がいくつか得られた。特に本年度はM3Kの基質特異性改変に成功したが、MVDの作製には至っていない。そこで、M3K遺伝子へのランダム変異導入によるMVDの作製を試み、大腸菌によるスクリーニング法の構築に取り組んだ。具体的には、最近同定された新奇リン酸化酵素とリコペン生合成経路を組み合わせ、IOH生成をリコペン蓄積による大腸菌コロニーの呈色として検出するポジティブスクリーニング法を考案した。これに必要となるIOH検出大腸菌株の作製に成功し、同株を用いたランダムスクリーニング法の条件検討にも取り組んだ。今後はMVD作製に向け、同スクリーニング法の改良に取り組む必要がある。また、上述のM3K変異体、既知のMVA経路関連酵素およびリコペン生合成経路を組み合わせ、現在自然界から見つかっていない人工MVA経路の構築と評価にも取り組んだ。実際に同経路が大腸菌内で機能する事を、リコペン生産量の増加を指標として確認した。今後、同経路の最適化を図ることで更なるイソプレノイド生産性の向上が期待される。

A number of studies have been reported on the microbial production of alternative fuels for solutions that are expected to be used in the production of compound solutions (IOH), and on the use of biosynthetic systems derived from xenobiotics and introduced into E. coli via the MVA pathway. The enzyme reaction and ATP consumption are necessary and there is room for improvement. MVA is a catalyst for the transformation of IOH from MVA to MVD, and improvements to existing IOH production systems are expected. In this study, two kinds of enzymes, MVA 3-K (M3K) and MVA 3-K (M3K), were identified as essential functional factors for MVD production. Comparison of X-ray crystallographic structures of enzymes, results of site-specific introduction, and methods of MVD production. In particular, the stroma specific modification of M3K was successful this year, and the MVD was successfully modified. The MVD was introduced into the genome of E. coli, and the MVD was constructed. The specific identification of novel enzymes and the synthesis of IOH in the production of E. coli and the detection of the enzyme and the synthesis of IOH in the production of Escherichia coli For this reason, IOH has successfully isolated E. coli strains, and the same strain has been used in the study of the conditions of the method. In the future, MVD system should be improved. In addition, the M3K variant mentioned above, the known MVA circuit-related enzymes and the synthesis of MVA circuits, and the construction and evaluation of artificial MVA circuits in nature are now available. In the meantime, the function of E. coli in the same pathway is confirmed by the index of increase in production volume. In the future, the optimization of the same circuit will be more efficient and productive.