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未解明一次代謝経路、非メバロン酸経路に関与する遺伝子の機能解析

参与未识别的主要代谢途径和非甲羟戊酸途径的基因的功能分析

基本信息

批准号：
14014212
负责人：
葛山智久
金额：
$ 3.84万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、非メバロン酸経路の欠損変異株を単離するための独自のスクリーニング系と枯草菌研究で構築された網羅的な遺伝子破壊株を最大限に活用し、非メバロン酸経路の遺伝子を同定、その機能解析を行うことにより、本経路の全容解明を目指す。前年度までに単離した1ytB欠損変異株は、γ-T細胞増殖誘導活性を有する非メバロン酸経路の中間体である4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate(HMBDP)を野生株と比較して約300倍蓄積していることが分かった。そこで、このHMBDP蓄積量の減少、すなわち、γ-T細胞増殖誘導活性の低下を指標に、非メバロン酸経路の欠損株をスクリーニングするためのアッセイ系を構築した。具体的には、メバロン酸経路遺伝子群で形質転換した1ytB欠損株に対してトランスポゾンを用いたランダム変異を導入した後、それらの変異株のγ-T細胞増殖誘導活性を一株ずつアッセイし、野生株と同等までにγ-T細胞増殖誘導活性が低下している変異株をスクリーニングする方法を開発した。上記アッセイ系を用いて約10000株のトランスポゾン導入株をスクリーニングしたところ、既知の非メバロン酸経路遺伝子である、dxs、dxr、ygbP、ychB、ygbB、gcpEの欠損株に加えて、新たにfldA遺伝子欠損株が得られた。fldAはflavodoxinをコードしている遺伝子でありflavodoxin reductaseと共にいくつかの還元反応に関与していることが知られている。そこで、gcpE遺伝子産物、flavodixin、flavodoxin redcutaseを含む反応系において、基質と考えられる2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphateを反応させたが、反応の進行を検出することはできなかった。このことは、gcpE遺伝子産物が酸素に極めて弱いことに起因すると考えられた。事実、他の研究者らにより、flavodoxinとflavodoxin reductaseの存在下、グローブボックス内で酸素を徹底的に排除した系において、gcpE遺伝子産物がMECDPをHMBDPに変換する酵素活性の検出にようやく成功した報告がなされた。

This study aims to identify the genetic components of the non-defective acid pathway, identify the functional components of the non-defective acid pathway, and clarify the overall content of the pathway. In the past year, 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate(HMBDP), an intermediate in the non-acid pathway, accumulated about 300-fold compared with wild strains. The decrease of HMBDP accumulation, the decrease of γ-T cell proliferation-inducing activity, and the establishment of a system of non-defective HMBDP pathway are indicators. Specifically, after introduction of the mutant gene into the mutant gene pool, a method was developed to induce the γ-T cell proliferation activity of a mutant strain with a low γ-T cell proliferation induction activity of a wild strain. About 10000 of the introduced strains were used in the above-mentioned system, and the known non-defective strains such as dxs, dxr, ygbP, ychB, ygbB and gcpE were added to the system, and the new defective strains such as fldA were obtained. fldA flavotoxin reductase and flavotoxin reductase GcpE gene products, flavodixin, flavodoxin redcutase, 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate, 2-C-methyl-D-erythritol, 2-cyclodiphosphate, 2-C-methyl-D-erythritol, 2-C-methyl-D-erythritol, 2-D-methyl-D-erythritol, 2-cyclodiphosphate, 2-C-methyl-D- The reason for this is that the product of gcpE is acid. In the presence of flavodoxin and flavodoxin reductase, the enzyme activity of MEDP and HMBDP was successfully detected.