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新規Ｎ６－メチルアデノシン修飾酵素の機能解析

新型N6-甲基腺苷修饰酶的功能分析

基本信息

批准号：
18J13582
负责人：
石神宥真
金额：
$ 0.96万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-25 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

報告者はこれまでに、U6 snRNAのN6-メチルアデノシン(m6A)を欠損しているメチル化酵素mtl16欠損分裂酵母株においてスプライシング異常が発生するイントロンの特徴として、5’エキソンの3’末端3塩基がU5 snRNAにあるUUU配列と塩基対合を形成しにくいものであるということを発見していたが、RNA-Seqデータから導かれた仮説であり直接は示されていなかった。そこで、U5 snRNAのUUU配列をAGA配列に入れ替えた変異体をmtl16欠損株で過剰発現した結果、AGA配列とエキソン配列が塩基対合を形成しうるイントロンについてそのスプライシング効率が一部回復した。この結果により、U5 snRNAとの相互作用が弱いイントロンがより強くmtl16欠損に影響を受けることが示され、U5 snRNAとU6 snRNAが協調して5’スプライスサイトを認識しているという仮説が補強された。これまではRNA-seqの結果と、U6 snRNAとは異なる配列での先行研究からのみm6Aが塩基対合を強化するという仮説を立てていたため、これを化学的な手法で検証することとした。分子内でU6 snRNAとイントロン配列を模した6塩基の塩基対を形成するRNAを転写合成し、酵素的にm6AをU6 snRNAのものに相当する位置に高い修飾率で導入した。これにより得られたRNAの塩基対の安定性を濃色効果で測定した結果、m6Aが無い場合と比較して、m6Aがあった場合融解温度が高いことが判明した。これにより、U6 snRNAの配列においてm6Aの存在がイントロンとの塩基対合を強化することが化学的に示された。分裂酵母U2 snRNA m6A修飾に必要な配列因子としては、U2 snRNA変異体に対する修飾再構成によりU2 snRNAの5'端と修飾部位周辺、およびその間にある二次構造が重要であることが解明された。

Reporter: U6 snRNAのN6-メチルアデノシン(m6A)を无码しているメチルoxidase mtl16 damaged fission yeast strainにおいてスプライシングAbnormal 発生するイントロンの特徴として、5’エキソンの3’Terminal 3塩baseがU5 snRNA にあるUUU arrangement と塩対合を成しにくいものであるということを発见していたが、RNA-Seqデータからguidanceかれた仮说でありDirect は说されていなかった.そこで、U5 snRNA's UUU arrangement, AGA arrangement, entry, replacement, allotype, mtl16 defective strain, overpass, AGA Arrangement とエキソン arrangement が塩対合を form しうるイントロンについてそのスプライシングefficiency が一合した.このRESULTS により、U5 snRNA とのInteraction がいイントロンがよりstrong くmtl16 Lack にAffected by けることがshowされ、U5 snRNAとU6 snRNA が coordination して 5’ スプライスサイトを cognition しているという仮说が reinforcement された.これまではRNA-seqのRESULTと、U6 snRNA とは iso-なる arrangement での pilot study からのみ m6A 塩 base 対合を strengthen するという仮说を立てていたため, これをchemical techniques and で検证することとした. Intramolecular でU6 snRNA とイントロンarray をmodule した6塩婩の塩対をform するRNA を転综合し, enzyme にm6AをU6 The snRNA has a relatively high modification rate, a relatively high position, and a high modification rate.これにより得られたRNAの塩対の stability and strong color effectでdetermination results, m6 It is clear that the melting temperature of A is higher than that of m6A when there is none.これにより、U6 snRNA のalignment においてm6A のがイントロンとの塩対合を Strengthen the することがchemistry に Show された. Fission yeast U2 snRNA m6A modified essential ligation factor としては, U2 snRNA allotype に対する modified and reconstituted によりU2 The modification site around the 5' end of snRNA and the secondary structure of the snRNA are also important to understand.