高等真核生物でのDSB修復におけるコヒーシン複合体の機能とその制御機構の解明

阐明高等真核生物中粘连蛋白复合物在 DSB 修复中的功能和调节机制

• 批准号: 22K06086
• 负责人: 東 寅彦
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06086/
• 关键词: コヒーシン; DSB修復; ダメージチェックポイント; ツメガエル卵抽出液; タンパク質精製; 姉妹染色体接着; 複製ストレス; リン酸化修飾; DNA修復

コヒーシンはDNA二重鎖切断(DSB)時において積極的に修復反応に関わる一方、その分子的なメカニズムは未だ明らかになっていない点が多い。本研究ではツメガエル卵抽出液を用いた試験管内実験系およびヒト培養細胞での複製停止モデル系を使って高等真核生物でのコヒーシンによるDSB修復の分子機構の解明を試みた。（１）DSB修復におけるコヒーシンの挙動を調べるために、ツメガエル卵抽出液内で染色体にDSBを導入した。制限酵素EcoRIを抽出液に加えることでDSBに依存したコヒーシンの再結合が観察されると予想したが、結果としてはコヒーシンの結合量に大きな変化は観察されなかった。コヒーシンの再結合を評価するためには、損傷前後で染色体に結合するコヒーシンを区別することが今後重要であると考えられる。（２）染色体に再結合したコヒーシンは新たに姉妹間を接着することが酵母では報告されている。接着成立が高等真核生物において起きているのかを明確にするためには接着を定量的に評価する方法が必要である。新たな接着検出系の構築のため、ヒト組換えコヒーシンの精製を目指した。HEK293細胞での一過的なタンパク質発現を試みたが正しいストイキオメトリーのタンパク質発現が観察されなかったことから、さらなる条件の検討が必要である。（３）コヒーシンのDSB応答の仕組みがヒトの細胞でも保存されているのかを調べるため、ヒトU2O S細胞の複製停止系を用いた。この実験系では、ヒト染色体上に複製ブロックを作り、DNA複製の進行を妨げることができる。複製停止に伴いコヒーシンおよびローダーの蓄積が観察されるかを免疫染色法で解析したが、さらなる蓄積は観察されなかった。一方、興味深いことにコヒーシンSmc1のリン酸化は大きく蓄積することが観察されたことから、複製停止時においてコヒーシンを介したチェックポイントの活性化が起きていると考えられる。

When DNA double lock cleavage (DSB) occurs, the active repair reaction is involved in one side, and the molecular reaction is involved in the other. In this study, we attempted to elucidate the molecular mechanism of DSB repair in vitro and in vitro. (1) DSB repair is regulated by the regulation of DSB activity in egg extracts. The restriction enzyme EcoRI extract was added to the DSB and the binding amount of EcoRI was determined. A review of chromosome recombination before and after injury (2) Chromosome recombination is a new phenomenon. Then establish a method for quantitative evaluation of higher eukaryotes. The new design system is constructed and refined. It is necessary to investigate the conditions for the quality development of HEK293 cells. (3) The replication arrest system of U2O cells was used in the preservation of DSB cells. The DNA replication process in the chromosome is very complicated. Replication stops and the accumulation of DNA is detected by immunostaining. When the virus is detected, the virus is activated.