Verification of gene-edited pig production method from Japan

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異種移植の開発に国産のCRISPR/Cas3法を検討している。既にCas9法でknockout(KO)経験のあるブタCMAHやb4GalNT2のKOと比較しながら、GalT(GGTA1)のKOをCas3法で進めた。まず、ブタでのgenome情報をもとにcrRNAをGGTA1の機能ドメインであるexon 9の上下に置いた（crRNA=#45と#86）。次に、４群、①群Control (No Cascade)、②群 Cascade+Cas3+#45、③群 Cascade+Cas3+#86、④群 Cascade+Cas3+#45+#86を置いた。＜Cascade:pX-puro/Cascade (=bpNLS-Cascade)、Cas3:BPNLS-hCas3、crRNA=45:pBS-U6-crRNA=45、crRNA=86:pBS-U6-crRNA=86 ＞これらをブタ線維芽細胞に遺伝子導入を行い、４８時間後の細胞を回収し、GSIB4を使ったFACS解析、およびゲノム抽出PCRにて解析した。FACSの結果としては、欠損は②群、④群で多くみられた。遺伝子変異に関しては、④群で一番多く認めた。より大きなサイズの変異はこの方法では確認できなかったが、CRISPR/Cas3によるKOでブタ線維芽細胞において確かな変異（del:294 – 754bp）が確認できた。次に、この④群 のCas3と#45-crRNA及び#8-crRNAをそれぞれpCXNに組み、pCXN/Cas3+#45-crRNA及びpCXN/Cas3+#45-crRNを作成し、これらを用いて、今度はブタ血管内皮細胞(SEC)に遺伝子導入を行い、SEC/GGTA1-KOの作出を試みた。同時にpCXN-GFPを導入し遺伝子効率を考慮しながら、再三に渡って試みるも、slectionに難渋しcloneの確立には至ってはいない。