Verification of gene-edited pig production method from Japan

日本基因编辑猪生产方法验证

• 批准号: 21K19527
• 负责人: 宮川 周士
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-07-09 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19527/
• 关键词: GGTA1; CMAH; CRISPR/Cas3; ブタ線維芽細胞; Hanganutziu-Deicher抗原; ブタ内在性レトロウイルス; 再生医療; バイオ人工臓器; ノックアウト; CRISPR

異種移植の開発に国産のCRISPR/Cas3法を検討している。既にCas9法でknockout(KO)経験のあるブタCMAHやb4GalNT2のKOと比較しながら、GalT(GGTA1)のKOをCas3法で進めた。まず、ブタでのgenome情報をもとにcrRNAをGGTA1の機能ドメインであるexon 9の上下に置いた（crRNA=#45と#86）。次に、４群、①群Control (No Cascade)、②群 Cascade+Cas3+#45、③群 Cascade+Cas3+#86、④群 Cascade+Cas3+#45+#86を置いた。＜Cascade:pX-puro/Cascade (=bpNLS-Cascade)、Cas3:BPNLS-hCas3、crRNA=45:pBS-U6-crRNA=45、crRNA=86:pBS-U6-crRNA=86 ＞これらをブタ線維芽細胞に遺伝子導入を行い、４８時間後の細胞を回収し、GSIB4を使ったFACS解析、およびゲノム抽出PCRにて解析した。FACSの結果としては、欠損は②群、④群で多くみられた。遺伝子変異に関しては、④群で一番多く認めた。より大きなサイズの変異はこの方法では確認できなかったが、CRISPR/Cas3によるKOでブタ線維芽細胞において確かな変異（del:294 – 754bp）が確認できた。次に、この④群 のCas3と#45-crRNA及び#8-crRNAをそれぞれpCXNに組み、pCXN/Cas3+#45-crRNA及びpCXN/Cas3+#45-crRNを作成し、これらを用いて、今度はブタ血管内皮細胞(SEC)に遺伝子導入を行い、SEC/GGTA1-KOの作出を試みた。同時にpCXN-GFPを導入し遺伝子効率を考慮しながら、再三に渡って試みるも、slectionに難渋しcloneの確立には至ってはいない。

CRISPR/Cas3 method for xenotransplantation development is discussed in the future. Both Cas9 and KO methods are used to compare GalT(GGTA1) and Cas3. The gene information of GGTA1 is located at the top and bottom of crRNA (crRNA=#45 and #86) The second group, the fourth group, ① group Control (No Cascade), ② group Cascade+ Cas3 +#45, ③ group Cascade+ Cas3 +#86, ④ group Cascade+ Cas3 +#45+#86 are set in the middle. <Cascade:pX-puro/Cascade (=bpNLS-Cascade), Cas3: BPNLS-hCas3, crRNA=45:pBS-U6-crRNA=45, crRNA=86:pBS-U6-crRNA =86 ><Cascade: pX-puro/Cascade (= bpNLS-Cascade), Cas3: BPNLS-hCas3, crRNA=45><Cascade: pX-puro/Cascade (= bpNLS-Cascade)><Cascade: pX-puro/Cascade (= bpNLS-Cascade), Cas3: BPNLS-hCas3, crRNA = 45: pBS-U6-crRNA = 45, crRNA = 86: pBS-U6-crRNA = 86><Cascade: pX-puro/Cascade:pX-puro/Cascade><Cascade: pX-puro/Cascade (= bpNLS-Cascade), Cas3: BPNLS- FACS results are negative, negative and negative. The children are different from each other, and the four groups are different. CRISPR/Cas3 is the most common type of cell in the cell line. It is confirmed that CRISPR/Cas3 is the most common type of cell line in the cell line. In addition, the Cas3 +#45-crRNA and Cas 3 +#8-crRNA of the 4 groups were prepared by pCXN, pCXN/Cas 3 +#45-crRNA and pCXN/Cas3+#45-crRN. At the same time, pCXN-GFP is introduced into the gene expression system, and the gene expression system is considered to be stable.

项目成果

CPISPR / Cas3 system for pig Gal-T (GGTA1)

猪 Gal-T (GGTA1) 的 CISPPR / Cas3 系统

• 发表时间: 2021
• 作者: Shuji Miyagawa;Masahito Watanabe;Kazuki Sato;Shuhei Kogata;Chiyoshi Toyama;Kazunori Masahata;Masafumi Kamiyama;Hiroshi Eguchi;Akira Maeda;Kazuto Yoshimi;Tomoji Mashimo;Hiroomi Okuyama;Hiroshi Nagashima
• 通讯作者: Hiroshi Nagashima

Suppression of xenogeneic innate immune response by a membrane-type human surfactant protein-A.

• DOI: 10.3892/etm.2022.11527
• 发表时间: 2022-07
• 期刊: Experimental and therapeutic medicine
• 影响因子: 2.7
• 作者: Chiyoshi Toyama;A. Maeda;Shuhei Kogata;Riho Yamamoto;Kazunori Masahata;T. Ueno;Masafumi Kamiyama;Y. Tazuke;H. Eguchi;H. Okuyama;S. Miyagawa

Testing the CPISPR / Cas3 system for the xenotransplantation field.

测试 CISPPR / Cas3 系统在异种移植领域的应用。

• 发表时间: 2021
• 作者: Shuji Miyagawa;Masahito Watanabe;Kazuki Sato;Shuhei Kogata;Chiyoshi Toyama;Kazunori Masahata;Masahumi Kamiyama;Hiroshi Eguchi;Akira Maeda;Kazuto Yoshimi;Tomoji Mashimo;Hiroomi Okuyama;Hiroshi Nagashima
• 通讯作者: Hiroshi Nagashima

Study of the CRISPR/Cas3 System for Xenotransplantation

异种移植CRISPR/Cas3系统的研究

• DOI: 10.1016/j.transproceed.2021.09.070
• 发表时间: 2022
• 期刊: Transplant Proc
• 作者: Miyagawa S;Watanabe M;Nagashima H;Sato K;Kogata S;Toyama C;Masahata K;Kamiyama M;Yamamoto R;Eguchi H;Maeda A;Yoshimi K;Mashimo T;Okuyama H.
• 通讯作者: Okuyama H.

The suppression of macrophage-mediated intestinal transplant rejection by C5a receptor antagonist.

C5a 受体拮抗剂抑制巨噬细胞介导的肠移植排斥反应。

• 发表时间: 2022
• 作者: Chiyoshi Toyama;Akira Maeda;Shuhei Kogata;Koki Takase;Tasuku Kodama;Kazunori Masahata;Takehisa Ueno;Masafumi Kamiyama;Yuko Tazuke;Hiroshi Eguchi;Katsuyoshi Matsunami;Shuji Miyagawa;Hiroomi Okuyama
• 通讯作者: Hiroomi Okuyama