ヒト末梢神経系のin vitro再構成系の構築による痛み緩和メカニズムの解明

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間葉系幹細胞（MSCs）は、再生医療やヒト由来の神経ネットワークモデリングへの応用が期待されており、添加する化学物質とその因子の組み合わせ、様々な共培養系の構築により、MSCsの神経への分化が試みられている。しかし、培養期間が長いことや、共培養細胞の状態に大きく依存するという欠点がある。最近、Rho経路は、MSCsの神経分化に重要な役割を果たすことが知られてきた。Rhoキナーゼ（ROCK）阻害剤Y-27632の添加は、形態的に神経細胞様への大きな変化が見られるものの、βIII-tublinの発現量はほぼ変わらないことや、神経細胞的な機能変化も知られていない。そこで、ヒト歯髄幹細胞(hDPSCs)に着目し、従来の神経分化誘導方法を再検討することを目的とした。hDPSCsを用いて、神経細胞のマーカーであるβIII-tublin、神経前駆幹細胞のマーカーであるnestinの発現量とその比率を免疫化学染色により定量した。さらに、神経分化の機能的変化を調べるために、KClやグルタミン酸等に対するカルシウム応答も調べた。これらの実験結果をもとに、神経分化の程度を評価しながら最適培養条件を絞り込んだ。まず、ラットより分離した海馬神経細胞とhDPSCsの共培養を行った結果、海馬神経細胞は神経分化誘導能を有するが、それは培養条件に依存した。そこで海馬神経細胞やアストロサイトの順化培地を、培養日数を様々に変えて取得し、さらにそれを段階的に希釈するなどの、12の条件からより良い分化条件を抽出した。次に、βIII-tublinとnestinの発現量とその比率を比較し、4条件を選択した。カルシウム応答波形から、機能的分化の観点から2条件に絞り込んだ。最後に、ROCK阻害剤との組み合わせで、海馬神経細胞馴化培地とアストロサイト馴化培地からの神経細胞への分化は重畳的に作用することがわかった。