Usefulness of nucleic acid amplification in search for responsible bacteria for sepsis.

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法医解剖事例は、検体採取時のコンタミネーションに加え、腐敗細菌や腸内細菌の増殖などの法医試料に特徴的な要因で、死体試料から特定の細菌が分離、同定されたとしても、それが原因菌であると断定できないという問題があり、敗血症を確実に診断することは難しい。しかし、同定された菌種による感染と解剖・検査所見との間に整合性が確認されるケースもあり、原因菌として矛盾しない微生物の存在の証明は法医診断に有用である。本研究計画では、viability PCR法（生細菌を選択的に増幅するPCR法）を利用した増幅法や核酸抽出法の検討をおこない、法医領域での敗血症原因菌の検索における核酸増幅の有用性を検証する。今年度は、過去の敗血症が疑われた解剖事例に同定された菌種をリスト化し、主要な菌種の純培養菌を購入し、これらを用いて生菌・死菌の分別条件の検討をおこなった。分別には、死菌由来DNAをDNA修飾色素であるEMA (ethidium monoazide)を用いて修飾することでPCR増幅を抑制し生菌由来DNAのみ検出する方法を用いた。EMA処理は、細菌にEMAを含む試薬を添加し浸透させた後、光照射（精度の高い安定したデータ取得が可能な専用装置を本研究費で購入した）するとEMAによりDNAが化学修飾される。純培養菌の生菌と死菌を準備し、EMA処理の時間や回数、EMA濃度を変えて、それぞれの菌種について、最適な死菌抑制効果が得られるEMA処理条件の検討をおこなった。死菌は、熱処理により膜を損傷することで調整し、DNAを抽出、確認は16S rRNA のPCR増幅によりおこなった。