Directed evolution of sequence-regulationg polyhydroxyalkanoatae synthase for novel biopolyester biosynthesis

用于新型生物聚酯生物合成的序列调节聚羟基脂肪酸合酶的定向进化

• 批准号: 22K05422
• 负责人: 冨田 宏矢
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05422/
• 关键词: ポリヒドロキシアルカン酸; 指向性進化; 生分解性プラスチック; 生合成

Error-prone PCR法によってランダム変異を導入したphaCAR変異遺伝子ライブラリーを作製し、これらを導入した大腸菌を3HHxを含む培地で培養した。PHAの合成量に応じて蛍光を発する蛍光色素ナイルレッドが含まれる培地で培養したところ、いくつかの変異体は親酵素よりも高い蛍光強度を示した。これらの変異体の変異点を同定した結果、N149D, F314L変異が見出され、これらの変異が3HHxの導入効率を高めていることが明らかとなった。続いて、F314に対して20種類全てのアミノ酸で一つずつ置き換えた飽和変異遺伝子ライブラリーを構築し、それぞれのポリマー合成量、3HHx導入率、モノマー配列を調べた。その結果、F314Hはいずれも高い結果を示し、3HB-3HHxからなるブロック共重合体を合成できることがわかった。さらにPhaCAR F314H変異体の組換えタンパク質を調製し、その酵素活性を調べたところ、3HHx-CoAに対して親酵素よりも高い酵素活性を示すことが明らかとなった。N149, F314をPhaCARのコンピュータ上での予想立体構造情報に当てはめたところ、F314はポリマー合成に直接関与する活性中心残基C315に隣接していた。そのため、F314への変異導入は基質選択に重要な役割を果たすことが示唆された。N149は活性中心からは離れたところに位置していたが、酵素活性に重要と思われるループ領域上のN396と相互作用していることが示唆された。この相互作用の変化が酵素の立体構造に影響を与え、その結果として基質特異性にも影響を与えた可能性がある。

用易易折错的PCR方法引入的随机突变制备了Phacar突变基因文库，并将已引入细胞的大肠杆菌培养在含有3HHX的培养基中。当在含有荧光染料尼罗红色的介质中培养，该介质根据合成的PHA量荧光，一些突变体的荧光强度高于母体酶。鉴定了这些突变体的突变点，发现N149D和F314L突变，表明这些突变提高了3HHX转移的效率。接下来，构建了一个饱和的突变基因文库，其中F314用所有20个氨基酸替换为一个一个，以及聚合物合成的量，3HHX引入速率和每个聚合物的单体序列。结果，发现两个F314HS均显示出很高的结果，并且可以合成由3HB-3HHX组成的块共聚物。此外，制备了Phacar F314H突变体的重组蛋白并检查其酶活性，并发现3HHX-COA表现出比父酶更高的酶活性。当N149将F314拟合到Phacar计算机上的预测构象信息时，F314与活动中心残基C315相邻，该残基C315直接参与聚合物合成。因此，有人认为将诱变成F314在底物选择中起重要作用。尽管N149远离活动中心，但有人建议它与环路区域的N396相互作用，这对于酶活性似乎很重要。这种相互作用的改变可能影响了酶的构象，因此也影响了底物特异性。

项目成果

機能改変型ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素のモノマー配列制御の特性解析

功能修饰的聚羟基脂肪酸合酶单体序列控制的表征

• 发表时间: 2022
• 作者: 富士 航至;Phan Thi Hien;細江 有美; Guex Maureen;友居 昌慶;冨田 宏矢;Zinn Manfred;松本 謙一郎
• 通讯作者: 松本 謙一郎

ポリエステル合成酵素の機能改変による新規ブロック共重合体の生合成

通过聚酯合酶的功能修饰生物合成新型嵌段共聚物

• 发表时间: 2022
• 作者: 富士 航至;Phan Thi Hien;細江 有美; Guex Maureen;友居 昌慶;冨田 宏矢;Zinn Manfred;松本 謙一郎;冨田宏矢
• 通讯作者: 冨田宏矢

中鎖モノマー認識に向けたポリヒドロキシアルカン酸合成酵素の基質特異性の改変

修饰多羟基链烷酸合酶的底物特异性以识别中链单体

• 发表时间: 2022
• 作者: 向井 太一;Phan Thi Hien;冨田 宏矢;松本 謙一郎
• 通讯作者: 松本 謙一郎

Directed Evolution of Sequence-Regulating Polyhydroxyalkanoate Synthase to Synthesize a Medium-Chain-Length?Short-Chain-Length (MCL?SCL) Block Copolymer

序列调节聚羟基脂肪酸酯合成酶的定向进化合成中链长短链长（MCL？SCL）嵌段共聚物

• DOI: 10.1021/acs.biomac.1c01480
• 发表时间: 2022
• 期刊: Biomacromolecules
• 影响因子: 6.2
• 作者: Phan Hien Thi;Hosoe Yumi;Guex Maureen;Tomoi Masayoshi;Tomita Hiroya;Zinn Manfred;Matsumoto Ken’ichiro
• 通讯作者: Matsumoto Ken’ichiro

HES-SO Valais-Wallis(スイス)

HES-SO 瓦莱-瓦利斯（瑞士）