Directed evolution of sequence-regulationg polyhydroxyalkanoatae synthase for novel biopolyester biosynthesis

Error-prone PCR法によってランダム変異を導入したphaCAR変異遺伝子ライブラリーを作製し、これらを導入した大腸菌を3HHxを含む培地で培養した。PHAの合成量に応じて蛍光を発する蛍光色素ナイルレッドが含まれる培地で培養したところ、いくつかの変異体は親酵素よりも高い蛍光強度を示した。これらの変異体の変異点を同定した結果、N149D, F314L変異が見出され、これらの変異が3HHxの導入効率を高めていることが明らかとなった。続いて、F314に対して20種類全てのアミノ酸で一つずつ置き換えた飽和変異遺伝子ライブラリーを構築し、それぞれのポリマー合成量、3HHx導入率、モノマー配列を調べた。その結果、F314Hはいずれも高い結果を示し、3HB-3HHxからなるブロック共重合体を合成できることがわかった。さらにPhaCAR F314H変異体の組換えタンパク質を調製し、その酵素活性を調べたところ、3HHx-CoAに対して親酵素よりも高い酵素活性を示すことが明らかとなった。N149, F314をPhaCARのコンピュータ上での予想立体構造情報に当てはめたところ、F314はポリマー合成に直接関与する活性中心残基C315に隣接していた。そのため、F314への変異導入は基質選択に重要な役割を果たすことが示唆された。N149は活性中心からは離れたところに位置していたが、酵素活性に重要と思われるループ領域上のN396と相互作用していることが示唆された。この相互作用の変化が酵素の立体構造に影響を与え、その結果として基質特異性にも影響を与えた可能性がある。

Error-prone PCR法によってランダム変異を導入したphaCAR変異遺伝子ライブラリーを作製し、これらを導入した大腸菌を3HHxを含む培地で培養した。PHAの合成量に応じて蛍光を発する蛍光色素ナイルレッドが含まれる培地で培養したところ、いくつかの変異体は親酵素よりも高い蛍光強度を示した。これらの変異体の変異点を同定した結果、N149D, F314L変異が見出され、これらの変異が3HHxの導入効率を高めていることが明らかとなった。続いて、F314に対して20種類全てのアミノ酸で一つずつ置き換えた飽和変異遺伝子ライブラリーを構築し、それぞれのポリマー合成量、3HHx導入率、モノマー配列を調べた。その結果、F314Hはいずれも高い結果を示し、3HB-3HHxからなるブロック共重合体を合成できることがわかった。さらにPhaCAR F314H変異体の組換えタンパク質を調製し、その酵素活性を調べたところ、3HHx-CoAに対して親酵素よりも高い酵素活性を示すことが明らかとなった。N149, F314をPhaCARのコンピュータ上での予想立体構造情報に当てはめたところ、F314はポリマー合成に直接関与する活性中心残基C315に隣接していた。そのため、F314への変異導入は基質選択に重要な役割を果たすことが示唆された。N149は活性中心からは離れたところに位置していたが、酵素活性に重要と思われるループ領域上のN396と相互作用していることが示唆された。この相互作用の変化が酵素の立体構造に影響を与え、その結果として基質特異性にも影響を与えた可能性がある。