殺蚊Btトキシンの小孔形成と殺虫活性－殺虫活性コントロール技術の開発に向けて－

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ヒトや環境に優しい微生物殺虫資材、土壌細菌Bacillus thuringiensis由来のCryトキシンは、標的細胞膜上に小孔を形成するトキシンである。しかし「小孔形成」と「殺虫活性」の関連は未だ不明な点が多く、それを明らかにすることが喫緊の課題となっている。そこで本研究ではCryトキシンの膜貫入領域を標的にした変異導入解析を通してこの課題を解決しようと考えた。殺蚊Cry4Aaトキシンの膜貫入領域(α4-α5)、特にトキシン小孔内腔側を構成するα4ヘリックスの極性アミノ酸残基をグルタミン酸(E)に置換した変異体(6種)を作製した。解析の結果、変異体の殺虫活性はトキシン小孔のコンダクタンス(イオン透過性)、そしてカチオン選択性(PK/PCl値)と相関していた。特にα4ヘリックスのH178残基を置換した変異体(H178E)では、トキシン小孔のカチオン選択性が減少することで殺虫活性が大きく減少すると考えられた。H178はCry4Aa小孔のイオン透過性に直接的/間接的に関与するアミノ酸残基であり、殺虫活性を制御可能なホットスポットの一つと考えられた。殺蚊Cry46Abトキシンの膜貫入領域であるβヘアピン(β8-β9)にも同様なホットスポット(K155)が見つかっている。そこで本研究ではK155をランダムなアミノ酸残基に置換した変異体のライブラリを構築した。合計160クローンの変異体をスクリーニングした結果、16種類に変異体が得られ、中には殺虫活性が上昇した変異体も複数種見つかった。電気生理学的解析の結果、殺虫活性が上昇した変異体が形成するトキシン小孔ではカチオン選択性の上昇が観察された。本研究の結果からトキシン小孔のコンダクタンス及びカチオン選択性が殺虫活性の決定要因になりうること、これらは膜貫入領域を標的とする変異導入によって改変可能であることが明らかになった。