低温地域に特化した持続的グルコース生産システムの創成

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令和4年度は、低温型ハイブリッドセルラーゼの酵素ユニットのうち、Sclerotinia borealisの溶解性多糖モノオキシゲナーゼ (sbLPMO) について、大腸菌、Pichia pastorisおよびBrevibacillusを宿主とした発現を試みた。S. borealisには3種類のLPMO候補遺伝子が存在していたため、それらをすべて発現ベクターにクローニングした。大腸菌では、組換えタンパク質はすべて不溶性画分として得られたことから、複数の条件下での可溶化やリフォールディングを試みたが、活性のある可溶化酵素は得られなかった。Pichia pastorisにおいては、そもそも目的タンパク質の発現を確認できなかった。これらに対し、Brevibacillusでは、2種類のsbLPMO遺伝子について、培地画分に組換えタンパク質が確認された。発現したsbLPMOは、C末端側に付加したHis-tagを利用して、Niキレートカラムによるアフィニティー精製した。過酸化水素の存在下で、得られたsbLPMOのうちの1種類について2,6-ジメトキシフェノールの分解活性を調べたところ、pH 8のときに最大の活性を示すことが明らかとなった。その他に、新規の酵素ユニットとして、S. borealisのセロビオースデヒドロゲナーゼ (sbCDH) のクローニングを行った。ただし、sbCDHの塩基配列は、データベース上のゲノムベースの配列とは異なる部分が複数存在することから、現在、他の種のCDHとの配列比較を行い、sbCDHの塩基配列の妥当性について検討している。