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インターフェロン誘導因子IRF-3の関与するシグナル伝達機構の構造生物学的研究

干扰素诱导因子IRF-3信号转导机制的结构生物学研究

基本信息

批准号：
16017203
负责人：
堀内正隆
金额：
$ 4.48万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

今年度は大腸菌における発現系を用いて,リン酸化IRF-3C末端側転写調節ドメイン(pIRF-3 189C)の大量発現を行った.まず目的蛋白質の発現条件の精密化,及び精製条件の最適化により大量かつ高純度に精製する方法を確立した.次にこの試料を用いて結晶化を試みた.結晶化のための初期スクリーニングには市販のGrid screen及びSparse matrixキットを適用したのだが結晶は得られなかった.そこで基本的な沈殿剤,バッファーを広い範囲で検討することで良質な結晶の作製に成功した.pIRF-3 189Cの単結晶は,放射光施設SPring8のビームラインBL41XUにおける測定で良好な回折データを示した.位相の決定には以前に我々が決定した非リン酸化体の結晶構造をモデルとして分子置換法を適用した.さらに分子モデルの構築及び構造の精密化を進め,最終的には1.7オングストロームの高分解能の立体構造を得ることができた.結晶中には非対称単位中に4分子が存在しており,その電子密度から直接リン酸基の位置まで同定することができた.分子間にはリン酸基を介した複数の相互作用が存在していたため,これまでに提唱されてきた機能発現に重要とされるリン酸基を介した相互作用機構については,より慎重な解釈が必要であると考えられる.今後はリン酸化体の結晶構造中に確認されたそれぞれの相互作用と転写活性との関連を明らかにするため,部位特異的変異の導入をはじめとした種々の機能解析を進める予定である.

This year, the development system of Escherichia coli was used, and a large number of developments were carried out by acidizing the terminal side of IRF-3C (pIRF-3 189C). To refine the production conditions and optimize the purification conditions of the target protein and establish a purification method for a large amount of high purity protein. The next step is to try to crystallize the sample. Crystallization of the initial stage of the grid screen and sparse matrix to apply to the crystallization of the Grid screen and sparse matrix. The production of good quality crystals was successful.pIRF-3 189C single crystals were successfully produced. The results showed that SPring8 and BL41 XU were successfully tested. Phase determination is based on molecular replacement method. The molecular structure and the structure of the molecular structure have been refined, and the final structure of the molecular structure has been obtained. 4 molecules are present in the crystal at the opposite position, and the electron density is constant at the same position. The interaction between molecules and acid groups is important for the development of functions. In the future, the interaction and activity of the acid body will be confirmed, and the functional analysis of the site will be determined.