Analyses on the function of Nkg7 in the regulation of lytic granule secretion and biogenesis

Nkg7调节溶解颗粒分泌和生物发生的功能分析

• 批准号: 22K06047
• 负责人: 江島 耕二
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06047/
• 关键词: 細胞傷害; 細胞傷害性T細胞; Nkg7; 傷害顆粒

細胞傷害性T細胞 (CTL) は，ウイルス感染細胞や腫瘍化した細胞を傷害して排除することにより生体の恒常性維持に寄与する細胞である。これらの細胞は細胞質内にパーフォリンやグランザイムと呼ばれる細胞傷害分子を含む顆粒 (傷害顆粒) をもち，その中身を標的細胞との接着面に放出することにより標的細胞を傷害することが知られている。しかし傷害顆粒の生合成や放出などの制御機構については未だ不明な点が多い。本研究では，最近我々が傷害顆粒の制御に必須であることを明らかにした新規細胞傷害関連分子Nkg7について，その作用機序を解明することを目的とする。具体的には細胞活性化前後のNkg7の細胞内の局在や，共局在・相互作用する分子，またそれに必要なNkg7分子上の部位を同定したい。方法としては，4回膜貫通型の傷害顆粒膜タンパクであるNkg7について，その顆粒内ループ部位や細胞質内C末端部位を一部タグで置換した変異体を作成し，それらをNkg7欠損CTLに導入した細胞を用いて，Nkg7の細胞内局在を解析し，共局在する分子や相互作用する分子を同定することを計画している。この計画の下，今年度は主に以下の２つの成果が得られた。① Nkg7について，第1ルーブの一部をFlagタグで置換した変異体，C末 (リソソームへの局在を決定するモチーフが含まれる) をFlagタグで置換えた変異体，及びその両方の置換を含む変異体を作成した。② Nkg7に対する市販の抗体で，フローサイトメトリーで使用できるものが無いため，Nkg7の第1ループとC末のペプチドをウサギに免疫することにより抗血清を作成した。得られた抗血清はペプチドに対して反応したが，C末のペプチドに対する抗血清についてはフローサイトメトリーでも使用することができた。今後これらの変異体や抗体を用いて，Nkg7の機能や局在について解析していく予定である。

Cell damaging T cells (CTL) は, ウ イ ル ス infected cells や swollen sores change し を た cell damage し て exclude す る こ と に よ り raw body の constancy to maintain に send and す る cells で あ る. こ れ ら の cell cytoplasm に は パ ー フ ォ リ ン や グ ラ ン ザ イ ム と shout ば れ る cellular damage molecular を む granules (damage) the particles を も ち, そ の body を target cells と の then face に release す る こ と に よ を り target cell damage す る こ と が know ら れ て い る. <s:1> The damage particles of <s:1> are synthesized in a や, released in a な, the control mechanism of <s:1> is に, <s:1> is て, <s:1> is not だ, the unknown な points are が, and there are many が. This study で は, recently I 々 が damage granulated の royal に must で あ る こ と を Ming ら か に し た cell damage masato new rules even molecular Nkg7 に つ い て, そ の function machine sequence を interpret す る こ と を purpose と す る. Before and after concrete に は cell activity の Nkg7 の intracellular の bureau in や, total bureau, in the interaction, す る molecules, ま た そ れ に necessary な Nkg7 molecule を の parts be し た い. Methods と し て は, 4 type transmembrane の DMG particles membrane タ ン パ ク で あ る Nkg7 に つ い て, そ の particles within ル ー プ parts や cytoplasm in C terminal parts を a タ グ で replacement し た - variant を し consummate, そ れ ら を Nkg7 owe damage of CTL に import し た cells を using い て, Nkg7 の bureau in analytical し を inside the cell, Co-localization in する molecule や interaction する molecule を congruation する <s:1> とを とを scheme て て る Under the に plan, the achievements of the following 2 に projects for this year are が and られた. 1) Nkg7 に つ い て, 1 ル ー ブ の a を Flag タ グ で replacement し た - variants, at the end of the C (リ ソ ソ ー ム へ の bureau decided in を す る モ チ ー フ が containing ま れ る) を Flag タ グ で replacement え た - variants, and び そ の struck party contains の replacement を む - variant を made し た. (2) Nkg7 に す seaborne る city vendor で の antibody, フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で use で き る も の が no い た め, Nkg7 の 1 ル ー プ と C at the end of the の ペ プ チ ド を ウ サ ギ に immune す る こ と に よ り antiserum を made し た. Have to ら れ た antiserum は ペ プ チ ド に し seaborne て anti 応 し た が, at the end of the C の ペ プ チ ド に す seaborne る antiserum に つ い て は フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー で も use す る こ と が で き た. Future こ れ ら の variations with や antibody を with い て, Nkg7 の function や bureau in に つ い て parsing し て い く designated で あ る.